一個(gè)棉花微管結(jié)合蛋白基因GhSP1L5的克隆及表達(dá)分析

李榕寇偉譚蘭賀怡梁卓李鴻彬，2

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003；2.石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

一個(gè)棉花微管結(jié)合蛋白基因GhSP1L5的克隆及表達(dá)分析

李榕1寇偉1譚蘭1賀怡1梁卓1李鴻彬1，2

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003；2.石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

利用RT-PCR技術(shù)從處于快速伸長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的棉花纖維組織中克隆得到Spiral1-Like（SP1L5）基因（GhSP1L5），其開放讀碼框?yàn)?15 bp，編碼105個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，生物信息學(xué)分析表明，GhSP1L5蛋白N端和C端較為保守，并含有SCOP結(jié)構(gòu)域，是典型的微管結(jié)合蛋白。進(jìn)化樹分析表明該基因與SP1L5家族基因的親緣關(guān)系較近。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-GhSP1L5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，獲得分子質(zhì)量約為12 kD的重組蛋白。QRTPCR結(jié)果分析表明GhSP1L5基因在開花后15和20 dpa的纖維組織中表達(dá)量較高，在棉纖維發(fā)育的其他時(shí)期及根、莖、葉組織中表達(dá)量較低。

棉花纖維 Spiral1-Like5基因 微管結(jié)合蛋白 表達(dá)

棉花纖維是全球重要的紡織原料之一，是第一大產(chǎn)天然纖維的作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界及我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中均占有十分重要的地位［1，2］。近年來(lái)由于我國(guó)紡織技術(shù)的發(fā)展以及國(guó)民需求的日益增長(zhǎng)，對(duì)棉花纖維的品質(zhì)提出了更高要求，亟待在纖維品質(zhì)方面進(jìn)行改良以滿足生產(chǎn)生活的需求。纖維的強(qiáng)度和長(zhǎng)度是棉花纖維品質(zhì)中重要的參考指標(biāo)，細(xì)胞的伸長(zhǎng)或膨大發(fā)育與纖維品質(zhì)形成密切相關(guān)［3］。

微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面都發(fā)揮著重要的作用［4］。微管的形成發(fā)育

與細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。微管結(jié)合蛋白（Microtubule associated proteins，MAPs）是一類結(jié)合于微管骨架上的蛋白，能夠促進(jìn)微管成束，幫助微管形成不同列陣。Spiral1（SPR1）是植物特有的能與微管正端相互作用的蛋白［5，6］，其同源蛋白Spiral1-Like（spiral 1 like，SP1L）結(jié)構(gòu)上與SPR1相似，都有幾乎相同的重復(fù)序列［7，8］，暗示了它們?cè)诠δ苌系南嗨菩?。從擬南芥中鑒定出5種SPR1的同源蛋白編碼基因，命名為SP1L1-SP1L5，它們?cè)诓煌钠鞴僦幸圆煌乃奖磉_(dá)。周質(zhì)微管能調(diào)節(jié)細(xì)胞延伸的方向，SPR1與周質(zhì)微管共定位，并且快速伸長(zhǎng)的細(xì)胞中SPR1的表達(dá)水平上升。SPR1突變能引起根軸旋轉(zhuǎn)、下胚軸變白、內(nèi)胚層和皮層細(xì)胞各向異性生長(zhǎng)降低，SPR1和SP1L均可以恢復(fù)由突變引起的細(xì)胞生長(zhǎng)異常的表型，這也暗示了SP1L在細(xì)胞生長(zhǎng)方向發(fā)育中的重要功能［6］。許多研究表明［6，9-11］，在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中微管的形成與發(fā)育發(fā)揮著重要作用，微管的形成和發(fā)育離不開微管結(jié)合蛋白。目前對(duì)于微管結(jié)合蛋白參與棉纖維發(fā)育的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

對(duì)棉花纖維中GhSP1L5基因的克隆及表達(dá)分析，將有助于解析微管結(jié)合蛋白參與棉纖維發(fā)育的重要功能并有助于解析棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制。因此本研究從棉花纖維組織中克隆得到GhSP1L5基因，分析該基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列特征并預(yù)測(cè)可能的功能，體外重組表達(dá)GhSP1L5蛋白，使用qRTPCR方法進(jìn)行半定量分析研究該基因在棉花纖維發(fā)育中的表達(dá)特征，旨在研究GhSP1L5基因參與棉花纖維發(fā)育的可能功能。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉徐142由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，纖維細(xì)胞經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存。E. coli Top10由本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pET-28a購(gòu)自大連寶生物公司。

凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取微量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ等相關(guān)酶購(gòu)自大連寶生物公司；其他相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自上海生工生物工程公司。

PCR儀（Biomotra Tpersonal）、電泳儀（Tannon Epson100型 ）、 高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋（HVE-50）、Eppendorf 5417 R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)和恒溫?fù)u床（HWY-100B）等。

1.2 方法

1.2.1 棉花總RNA的提取 所使用的研缽經(jīng)高壓滅菌和酒精灼燒，其他器皿均經(jīng)DEPC處理，根據(jù)改良的CTAB法提取棉花總RNA［12］。

1.2.2 GhSP1L5基因的克隆 從GenBank EST數(shù)據(jù)庫(kù)中所獲得的完整cDNA ORF基因片段進(jìn)行保守性分析后，利用Primer Premier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用Prime-ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA［13］，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)的GhSP1L5基因。

在GhSP1L5和表達(dá)載體pET-28a兩端設(shè)計(jì)BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)（下劃線）和保護(hù)性堿基：正向引物：5'-CGGGATCCATGAGTAGAGGTGGGAGCT-3'；反向引物：5'-CCGCTCGAGCTTCTCACCAAACAGGTAACC-3'。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃預(yù)變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃存放。

1.2.3 蛋白質(zhì)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析 蛋白質(zhì)序列比對(duì)通過(guò)Clustalx1.81軟件和NCBI網(wǎng)站在線完成，通過(guò)MEGA軟件完成進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4 重組GhSP1L5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 原核表達(dá)載體pET28a-GhSP1L5的構(gòu)建、鑒定、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析參考實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法完成［14，15］。

1.2.5 棉花GhSP1L5基因QT-PCR分析 樣品采集：徐142野生型棉花幼苗根、莖、葉的準(zhǔn)備：用自來(lái)水浸泡棉種1-2 dpa，待露出培根后移栽入土中進(jìn)行培養(yǎng)，約7 dpa左右待幼苗長(zhǎng)出真葉后可進(jìn)行采樣；棉纖維胚珠混合樣的準(zhǔn)備：將棉花花朵授粉當(dāng)天命名為0 dpa，標(biāo)記授粉當(dāng)天的花朵若干，之后試驗(yàn)需要分別采取授粉后-3、0、3、5、10、15和20 dpa（Days post anthesis授粉后天數(shù)）的纖維和胚珠組織混合材料、10 dpa無(wú)長(zhǎng)絨無(wú)短絨突變體胚珠材料、棉花根、莖、葉材料，以液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)?/p>

用。根據(jù)改良的CTAB法提取各材料總RNA［16］，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，使用TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，運(yùn)用LightCycler 480 System對(duì)GhSP1L5基因的表達(dá)量進(jìn)行QT-PCR分析。選擇UBQ7為內(nèi)參基因，引物序列為：上游：5'-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3'；下游：5'-GGGCTTGGCTTGATCTT-3'。

GhSP1L5的QT-PCR的引物序列為：上游：5'-CCTTGGGCTACCTCTTTGG-3'；下游：5'-TGAATTCTGTCCTTGAGCCC-3'。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃預(yù)變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 棉花GhSP1L5基因克隆

使用CTAB法提取棉花纖維組織中的總RNA：所提取的總量RNA呈現(xiàn)28S、18S完整條帶，同時(shí)28S的含量約為18S的2倍，所提取的RNA質(zhì)量較好，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄及基因克隆的試驗(yàn)（圖1-A）。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到特異性條帶，經(jīng)測(cè)序正確后獲得GhSP1L5基因的全長(zhǎng)開放讀碼框（圖1-B），包含315個(gè)堿基對(duì)的核苷酸，編碼含有105個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

圖1 棉花纖維組織總RNA提取（A）及GhSP1L5基因的克?。˙）

2.2 序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析

將GhSP1L5基因的cDNA序列翻譯為氨基酸序列，并與以下幾種微管結(jié)合蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比：擬南芥AtSPR1、擬南芥AtSP1L1-5、野草莓FvSP1L5、黃瓜CsSP1L5、玉米ZmSPR1、番茄SlSP1L、蓖麻RcSP1L。結(jié)果顯示，植物中的GhSP1L5蛋白質(zhì)在N端和C端的氨基酸序列相似性較高，GhSP1L5蛋白質(zhì)具有保守的結(jié)構(gòu)域，黑色部分為保守的氨基酸序列，灰色部分為保守性一般的序列。GhSP1L5蛋白包含多個(gè)微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)（圖2-A虛線所示）和與蛋白相互作用相關(guān)的SCOP結(jié)構(gòu)域（圖2-A實(shí)線所示）。進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖2-B）表明GhSP1L5與黃瓜CsSP1L5在進(jìn)化親緣關(guān)系上較近。

2.3 原核表達(dá)載體pET28a-GhSP1L5的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)測(cè)序后比對(duì)正確的重組質(zhì)粒pGEM-TGhSP1L5和pET-28a原核表達(dá)載體同時(shí)用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達(dá)載體大片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化成功的單克隆做菌落PCR鑒定（圖3-A），PCR鑒定為陽(yáng)性單菌落的搖菌提取其質(zhì)粒進(jìn)一步做雙酶切鑒定（圖3-B），成功構(gòu)建pET28a-GhSP1L5原核表達(dá)載體。

2.4 重組GhSP1L5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的pET28a-GhSP1L5重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，經(jīng)PCR篩選鑒定后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)，提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖4）分析，獲得了大小約為12 kD左右的重組蛋白GhSP1L5。

2.5 棉花GhSP1L5基因的表達(dá)特征分析

通過(guò)定量PCR分析GhSP1L5基因在棉花幼苗根、莖、葉，棉花開花前-3、0 dpa和開花后3、5、10、15、20 dpa的纖維和胚珠組織，以及無(wú)長(zhǎng)絨無(wú)短絨突變體（fl）開花后10 dpa的胚珠中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖5）表明，GhSP1L5基因野生型棉花開花后15和20 dpa的纖維組織中表達(dá)較高，在根、莖、葉中及其他發(fā)育時(shí)期的纖維組織中表達(dá)較低。說(shuō)明GhSP1L5基因的表達(dá)可能與棉花纖維伸長(zhǎng)及次生壁發(fā)育有關(guān)。

3 討論

微管在細(xì)胞發(fā)育、形態(tài)建成和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)參與細(xì)胞各種生理活動(dòng)

而發(fā)揮調(diào)控植物生長(zhǎng)的作用，如細(xì)胞分裂、胞間運(yùn)輸、染色體分離、和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［17-20］。植物細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，微管列陣會(huì)依次轉(zhuǎn)換，這一過(guò)程離不開微管結(jié)合蛋白的參與，微管結(jié)合蛋白通過(guò)影響植物細(xì)胞骨架形成進(jìn)而參與細(xì)胞伸長(zhǎng)與膨大過(guò)程。SP1L是植物特有的一種微管結(jié)合蛋白，作用于微管的正端，與微管的聚合密切相關(guān)［9，10］。

圖2 GhSP1L5的氨基酸序列比對(duì)（A）及進(jìn)化樹分析（B）

圖3 pET28a-GhSP1L5原核表達(dá)載體構(gòu)建（A）及雙酶切鑒定（B）

圖4 GhSP1L5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

圖5 GhSP1L5在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析

棉纖維細(xì)胞是由胚珠外珠被表皮層分化而來(lái)的單細(xì)胞，在纖維發(fā)育過(guò)程中周質(zhì)微管的排列發(fā)生活躍的變化，微管骨架的形成及發(fā)育與棉纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)［9，21］。本研究從棉花纖維組織中克隆獲得一個(gè)微管結(jié)合蛋白基因GhSP1L5，該蛋白屬于典型的SP1L家族，具有多個(gè)微管結(jié)合位點(diǎn)和功能結(jié)構(gòu)域，暗示了其可能與微管結(jié)合相互作用并參與纖維細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。植物微管結(jié)合蛋白可以調(diào)控植物微管骨架的動(dòng)態(tài)和組織，以及微管與其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的連接，從而在植物細(xì)胞的形態(tài)、分化和發(fā)育等生理過(guò)程中起作用［22-28］。spr1突變體中的周質(zhì)微管排列表現(xiàn)異常，SPR1可以通過(guò)調(diào)節(jié)周質(zhì)微管進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞延伸的方向［6，8，16］。

GhSP1L5基因在開花后15-20 dpa的纖維組織中表達(dá)量較高，可能與棉花纖維伸長(zhǎng)發(fā)育和次生壁形成有關(guān)。微管的形成與發(fā)育在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［29］。微管作用的發(fā)揮離不開微管結(jié)合蛋白的參與。周質(zhì)微管骨架的排列方式與細(xì)胞壁纖維素微纖絲的排列極為相似，在纖維發(fā)育過(guò)程中，二者總是發(fā)生同樣的陣列改變，利用秋水仙素等抑制劑能夠破壞微管結(jié)構(gòu)導(dǎo)致纖維素微纖絲發(fā)生相似的損壞，SP1L可能通過(guò)與微管相互作用對(duì)纖維細(xì)胞壁微纖絲的結(jié)構(gòu)和排列起控制作用［30，31］。

許多研究結(jié)果表明微管結(jié)合蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。棉花微管結(jié)合蛋白GhSP1L5可能參與了棉花纖維發(fā)育過(guò)程，后期將進(jìn)一步開展GhSP1L5蛋白質(zhì)相互作用研究、轉(zhuǎn)化擬南芥同源基因突變體研究、轉(zhuǎn)化裂殖酵母研究等工作，進(jìn)一步驗(yàn)證GhSP1L5基因在植物細(xì)胞發(fā)育中的重要功能。本試驗(yàn)為深入研究GhSP1L5基因調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)功能及其參與細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供一定的參考。

4 結(jié)論

本研究從發(fā)育的棉花纖維組織中克隆得到GhSP1L5基因，GhSP1L5蛋白具有多個(gè)微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)和SCOP結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-GhSP1L5并通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析獲得了大小約為12 kD左右的重組蛋白質(zhì)，定量PCR分析顯示GhSP1L5基因在開花后15和20 dpa的纖維組織中表達(dá)量較高。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of a Cotton Microtubule Associated Protein Gene of GhSP1L5

Li Rong1Kou Wei1Tan Lan1He Yi1Liang Zhuo1Li Hongbin1，2
（1. College of Life Sciences of Shihezi Universtiy，Shihezi 832003；2. Key Laboratory of Agrobiotechnology of Shihezi University，Shihezi 832003）

A cotton Spiral1-Like5（GhSP1L5）full-length open reading frame（ORF）cDNA was cloned from fast elongating fiber tissue by RT-PCR method, The GhSP1L5 gene contains 315 bp necleotides and codes a protein of 105 amino acids. Through sequence function analysis and homology sequence alignment, GhSP1L5 protein includes several microtubule associated protein binding sites and SCOP domains. Phylogenetic tree analysis showed that GhSP1L5 has a similar relationship with SP1L5 protein family. Prokaryotic expression vector pET28a-GhSP1L5 was constructed and transformated into E.coli BL21（DE3）. Recombinant GhSP1L5 protein was obtained after induction by IPTG and SDS-PAGE analysis with a MW of ～12 kD. Quantitative RT-PCR analysis showed that the GhSP1L5 gene expresses highly at 15 dpa and 20 dpa fiber tissues compared with the expressions in root, stem, leaf and fiber tissuse of other development stages. GhSP1L5 cloning and expression analysis establish a basis for its further functions in cotton fiber development.

Cotton fiber Spiral1-Like5 gene Microtubule associated protein Expression

2014-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260339），兵團(tuán)創(chuàng)新項(xiàng)目（2012BB050，2013CB010），石河子大學(xué)杰青項(xiàng)目（2012ZRKXJQ03）

李榕，女，碩士研究生，研究方向：植物基因工程；E-mail：782348048@qq.com

李鴻彬，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：lihb@shzu.edu.cn