誘導性多能干細胞與腎臟再生

劉　熹　綜述　余　晨　審校

急性腎損傷和慢性腎臟病發(fā)病率逐年升高，患者進展至終末期腎病需維持性透析治療，其病死率高，且加重社會負擔。腎臟移植存在器官短缺、免疫排斥反應等問題，故需尋找更好的治療方法。誘導性多能干細胞(iPSC)可定向分化為腎系細胞，參與腎臟損傷后的修復，且其來源于體細胞，取材簡便，無明顯免疫排斥反應，避免倫理學爭議，因而在腎臟再生領域最具發(fā)展前景。

干細胞分類及比較

干細胞是一類具有高度增殖和多系分化能力的細胞。干細胞根據(jù)分化潛能大小分為多能干細胞和多功能成體干細胞(圖1)[1]。多能干細胞包括胚胎干細胞(ESC)和iPSC，可分化為內、中、外三胚層細胞。多功能成體干細胞包括間充質干細胞(MSC)、造血干細胞(HSC)和生殖細胞。獲取ESC需毀損胚胎，細胞來源受限，體內注射可致畸胎瘤。MSC及HSC體外培養(yǎng)、擴增相對容易，但其分化潛能較ESC和iPSC減弱。

圖1　干細胞種類及分化潛能[1]

iPSC的產生及鑒定

2006年，Yamnaka研究小組從24個候選基因中篩選出四個基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，應用逆轉錄病毒將這4個基因的cDNA導入小鼠成纖維細胞，轉染后的成纖維細胞在ESC培養(yǎng)環(huán)境中生長成胚胎干細胞樣集落，并表達ESC絕大部分標志基因，移植入裸鼠皮下可形成畸胎瘤，具有內、中、外三胚層細胞特征，植入胚泡可形成小鼠胚胎，因此被命名為iPSC[2]。2007年,該小組應用相同的轉錄因子將人類皮膚成纖維細胞誘導為iPSC[3]。iPSC體積小，核/質比高，細胞排列緊密，表達ESC內源性基因Oct4，Sox2，Nanog，Lin28，DPPA4，同時表達ESC標志性抗原，如腫瘤識別抗原TRA-1-81、TRA-1-60，階段特異性胚胎抗原SSEA3和SSEA4，其DNA甲基化模式及組蛋白修飾情況與ESC相似。2009年,我國科學家利用iPSC通過四倍體囊胚注射技術得到存活并具有繁殖能力的小鼠，證明iPSC與ESC一樣具有相同的分化潛能[4]。

多能干細胞誘導技術進展

自iPSC產生后，誘導技術不斷改進，在誘導因子方面，c-Myc和Klf4與腫瘤發(fā)生相關， 研究發(fā)現(xiàn)L-Myc較c-Myc誘導效率高，腫瘤形成風險低[5]。2008年，Kim等[6]用Oct4聯(lián)合Klf4或c-Myc將神經干細胞誘導為iPSC;2009年,該研究組僅用Oct4一種轉錄因子即將神經干細胞誘導為iPSC[7]。用Oct4,Sox2兩種轉錄因子，轉染人類近端腎小管上皮細胞，13d后可得到iPSC，其上皮細胞標志抗原CD13表達下調，腎臟祖細胞標志抗原CD10、CD133、CD24持續(xù)表達，其他干細胞基因的表達與胚胎干細胞相同[8]。目前認為，c-Myc啟動了體細胞重編程，與重編程效率相關，在體細胞向干細胞轉變的過程中，只有Oct4是唯一必需的誘導因子。與普通體細胞相比，成體干細胞誘導效率更高，需要插入的誘導因子少。在誘導載體方面，逆轉錄病毒轉染效率高，但隨機插入宿主基因存在激活原癌基因風險，目前采用質粒[9]、Piggy轉座子[10]等非整合型載體同樣可成功誘導多能干細胞。

iPSC誘導效率低制約其臨床應用，最初體細胞重編程效率僅0.001％～0.01％。抑制或增強某些信號通路、改變誘導環(huán)境等均可提高誘導效率，如添加組蛋白去乙?；敢种苿11]、Wnt信號通路激活劑[12]、轉化生長因子β(TGF-β)信號通路抑制劑[13]、維生素C[14]及骨形態(tài)發(fā)生蛋白[15]等。將iPSC培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度從21％降到5％,誘導效率可提高2.5～4.2倍，進一步降低氧濃度到1％,則會導致部分細胞死亡[16]。在誘導過程中調節(jié)miRNA-302的水平，增強細胞整體去甲基化水平，也可提高誘導效率[17]。

腎臟損傷的修復再生機制

傳統(tǒng)觀點認為腎臟是不可再生的器官，胚胎36周后即無新的腎單位形成[18]。在腎臟包囊壁層上皮細胞中存在CD133+CD24+腎臟祖細胞[19]，當腎臟損傷時，MSC、HSC自骨髓歸巢至腎臟，與腎臟祖細胞及少量停留在G1期的腎小管上皮細胞一起參與損傷后修復再生。這些細胞一方面直接分化為足細胞、腎小管上皮細胞等參與修復，另一方面調節(jié)炎癥因子白細胞介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，γ干擾素(IFN-γ)和抗炎因子IL-10、成纖維細胞生長因子(FGF)、TGF-α和B淋巴細胞瘤2蛋白(Bcl-2)的分泌來減輕局部炎癥反應，促進腎臟再生修復。在腎臟損傷動物模型中，移植外源性干細胞也可促進腎臟修復。外源性干細胞可通過尾靜脈、頸動脈、腎動脈及腎皮質局部注射等方式移植至體內，治療效果報道不一，總體來說通過腎動脈和腎皮質直接注射技術，干細胞腎臟歸巢率高，但局部損傷大，通過頸動脈、尾靜脈等途徑注射則干細胞歸巢率低，但易于操作。

iPSC促進腎臟再生策略

異體腎臟移植技術成熟，但供體匱乏。由于腎臟結構復雜，利用自體細胞進行完整器官克隆尚未取得成功。目前臨床上最普遍的是腎功能部分受損，仍殘存有功能的腎單位，對于這部分患者，研究主要集中在將體外擴增的iPSC先定向分化為特定的腎系細胞，再移植入體內,在原有腎臟結構中進行細胞和功能修復(圖2)[20]。

圖2　誘導性多能干細胞誘導及分化示意圖[20]

腎系細胞誘導為iPSC人體絕大多數(shù)體細胞均可誘導為多能干細胞，iPSC具有一定的記憶功能,傾向于分化為其最初來源的細胞[21]，因此將腎系細胞誘導為多能干細胞，更有利于修復腎臟損傷。Song等[22]用逆轉錄病毒轉染OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4至成年男性腎臟系膜細胞，12d后這些系膜細胞與ESC形態(tài)相似，高表達堿性磷酸酶，并表達OCT4、腫瘤識別抗原TRA-1-60、TRA-1-81。將這些未分化的腎臟源性iPSC注入免疫缺陷小鼠中，可形成畸胎瘤。我國Wang等[23]將載有Oct4,Sox2,c-Myc 和 Klf4四種轉錄因子的慢病毒轉染2天齡C57BL/6幼鼠腎小管上皮細胞，21d后轉染成功的腎小管上皮細胞表現(xiàn)出ESC形態(tài)，并表達c-Myc、FGF-4、階段特異性胚胎抗原1、端粒酶逆轉錄酶基因、NANOG、Oct4、Sox2和REX-1，在體外經誘導可分化為內、中、外胚層細胞[23]。獲取腎臟固有細胞用于誘導多能干細胞常需要進行有創(chuàng)操作，增加了治療難度。Zhou等[24]收集人尿液中脫落的腎小管上皮細胞，應用病毒轉染的方法得到iPSC，具有簡便、經濟、無創(chuàng)、誘導效率高及成功率高的優(yōu)點，提示尿液中脫落的腎臟細胞是iPSC的理想來源。

iPSC向腎系細胞定向分化腎臟損傷涉及足細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞等多種細胞，將iPSC定向分化為特定類型的腎系細胞，可直接參與修復腎臟損傷。胚胎期腎臟發(fā)育經歷前腎、中腎、后腎三個階段，后腎由輸尿管芽、生后腎間充質組織及基質細胞組成，這些細胞在一系列誘導信號分子作用下發(fā)生復雜的間充質細胞向上皮組織轉化。在腎臟發(fā)育過程中，有4個基因至關重要，分別是威爾氏瘤抑制基因(WT-1)，Adrenalmarker，Rennin和Kallikrein。WT-1在早期腎臟生成中起核心作用，介導間充質細胞向上皮細胞轉化[25]。腎臟發(fā)育還涉及MYC、活性氧類(ROS)、同源盒基因(HOX)、PAX等基因及表皮生長因子(EGF)、TGF-α、肝細胞生長因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)等表達，在iPSC的分化過程中加入這些調節(jié)因子，可定向誘導其向特殊腎系細胞分化。

Song等[26]在培養(yǎng)基中加入激活素A、維甲酸和BMP-7，成功將腎臟系膜細胞來源的iPSC誘導分化為類足細胞樣細胞[26]。這些類足細胞樣細胞具有正常足細胞形態(tài)，表達裂隙膜蛋白和突觸極蛋白，并具有增殖潛能。Araoka等[27]應用小分子糖原合成酶激酶3抑制劑CHIR99021和維甲酸受體拮抗劑AM580誘導人iPSC分化為中胚層腎源性細胞，可明顯提高誘導率(達80％)，同時縮短誘導時間至5d。這些中胚層腎源性細胞可分化為多種腎臟細胞，并形成腎小管樣結構。Morizane等[28]比較了小鼠ESC和纖維母細胞來源的iPSC定向分化為腎系細胞，研究提示iPSC和ESC均可分化為成熟腎小管上皮細胞和足細胞，其中iPSC誘導效率及速度低于ESC，但iPSC具有保持多能性的傾向，激活素具有促進ESC和iPSC定向分化為腎小管樣細胞的作用。總之，iPSC具有明確的分化為腎系細胞的潛能，但是由iPSC定向分化為某一種特定的腎臟細胞目前缺乏統(tǒng)一的誘導分化標準，且分化而來的腎臟細胞功能與成熟腎臟細胞相比仍差距。

iPSC在腎臟損傷動物模型中的應用iPSC對腎臟急性缺血再灌注損傷及慢性間質纖維化均具有修復再生作用。Lee等[29]將iPSC通過腎內動脈顯微注射到缺血再灌注急性腎損傷大鼠體內發(fā)現(xiàn)，iPSC減輕了腎臟病理損傷程度，改善腎功能，顯著降低了病死率；該研究還觀察到iPSC具有減輕氧化應激、抗炎及抗凋亡效應。將常染色體顯性多囊腎病患者體細胞誘導為iPSC，再在這些細胞中篩選發(fā)生自發(fā)基因修復的iPSC，用于治療多囊腎病，結果觀察到攜帶有PKD1+/R+的iPSC的成年嵌合體小鼠中囊腫形成的概率明顯低于攜帶有近親PKD1+/-的iPSC的成年嵌合體小鼠,且與野生型鼠比較無統(tǒng)計學差異[30]。然而目前iPSC治療腎臟疾病研究局限于小樣本觀察性研究，其修復再生作用尚待進一步驗證，修復再生機制仍不明確。

iPSC免疫原性研究

理論上講，體細胞來源的iPSC用于自體移植不存在免疫排斥反應。然而，目前缺乏統(tǒng)一穩(wěn)定的體細胞重編程及再分化體系，iPSC在誘導分化過程中其人類組織相容性抗原(HLA)是否會發(fā)生變化，引發(fā)免疫排斥反應尚無定論。2011年《Nature》發(fā)表論文，將C57BL/6鼠成纖維細胞來源的iPSC與C57BL/6鼠的ESC移植至C57BL/6鼠體內，iPSC引發(fā)了免疫排斥反應，無法形成正常的畸胎瘤組織，而ESC則未引起免疫排斥，形成了正常的畸胎瘤。通過全基因組表達譜分析，iPSC形成的不正常的畸胎瘤組織免疫相關基因Hormad1和Zg16過表達，導致iPSC免疫原性的改變[31]。2013年《Nature》再次發(fā)表論文，將iPSC定向誘導為皮膚和骨髓組織后再移植至C57BL/6鼠體內，結果顯示分化后的iPSC中Hormad1和Zg16并無過表達現(xiàn)象，且未引起免疫排斥反應[32]。iPSC自體移植費時費力，貽誤治療時機，構建不同HLA表型的iPSC庫進行異體移植具有廣闊的應用前景。

小結：我國慢性腎臟病發(fā)病率約10％，迄今仍無有效的方法逆轉疾病進展，iPSC是較為理想的腎臟再生資源。然而iPSC誘導及再分化機制仍未闡明，缺乏統(tǒng)一的技術規(guī)范。iPSC誘導過程中涉及轉錄因子激活和病毒基因隨機插入，染色質處于不穩(wěn)定狀態(tài)，具有較大致瘤風險，安全性尚無保證。此外，目前動物實驗中iPSC移植方式及時機缺乏高質量的隨機對照試驗，已有數(shù)據(jù)局限于小樣本觀察性研究，距離其臨床應用還有大量工作需要論證。

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