小鼠實(shí)驗(yàn)性小花棘豆中毒的病理學(xué)觀察

王 帥 賈琦珍 胡建軍 陳根元 張 玲

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

小花棘豆(OxytropisglabraDC)為豆科棘豆屬植物，有醉馬草、馬絆腸、絆腸草、苦馬豆等多種俗稱，廣泛分布于新疆和田、阿克蘇等地區(qū)，具有根系發(fā)達(dá)，繁殖系數(shù)高，耐旱，耐貧瘠，返青早，多種籽，生命力強(qiáng)等特性[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，阿克蘇地區(qū)271. 97萬hm2天然草場(chǎng)中廣泛叢生小花棘豆的面積超過40萬hm2，每年采食小花棘豆中毒的家畜占放牧家畜總數(shù)的10%左右，超過50%的中毒家畜死亡，小花棘豆的危害已嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)生產(chǎn)[2]。近年來國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)小花棘豆毒性方面的研究較多，高超等[3]，宋麗等[4]，米克熱木等[5]分別研究了小鼠小花棘豆急性中毒、亞急性中毒和亞慢性中毒的病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可導(dǎo)致動(dòng)物肝、腎、脾、心、腦等器官細(xì)胞空泡變性，尤以小腦浦肯野細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、腎臟近曲小管上皮細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)部上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞變性最為明顯，從而使動(dòng)物表現(xiàn)出以神經(jīng)機(jī)能障礙為特點(diǎn)的中毒癥狀。但小花棘豆化學(xué)成分組成復(fù)雜，不同地區(qū)小花棘豆化學(xué)成分間存在較大差異[6]，本試驗(yàn)通過對(duì)新疆南疆地區(qū)小花棘豆攻毒小鼠病理組織學(xué)指標(biāo)的分析，為小花棘豆毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

小花棘豆由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組提供，采自阿拉爾市托喀依鄉(xiāng)，樣品為風(fēng)干樣。

蘇木精，伊紅，鹽酸，乙醇，二甲苯，石蠟，阿拉伯樹膠等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(Leica公司RM2126)，數(shù)碼互動(dòng)光學(xué)顯微鏡(Motic DMBA300-B)，智能型生物組織包埋機(jī)(浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠YD-6D) 。

1.2 試驗(yàn)小鼠及小鼠日糧

試驗(yàn)動(dòng)物選用6～8周齡昆明種小鼠，共40只，體重為(20±2)g，雌雄各半，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站提供。將小花棘豆粉分別按1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的比例與飼料混合。小鼠飼料組成為：面粉350 g/kg，玉米粉240 g/kg，豆餅200 g/kg，麩皮100 g/kg，魚粉50 g/kg，酵母粉10 g/kg，植物油10 g/kg，魚肝油10 g/kg，食鹽10 g/kg，骨粉10 g/kg，礦物質(zhì)添加劑9 g/kg。維生素添加劑1 g/kg[7]。利用顆粒飼料機(jī)將其制成顆粒料。

1.3 小鼠小花棘豆中毒模型的建立

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，每組10只小鼠，分籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。對(duì)照組僅飼喂飼料，試驗(yàn)組分別飼喂含有小花棘豆1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的混合飼料。試驗(yàn)持續(xù)63 d。每天觀察并記錄各試驗(yàn)組小鼠的飲食狀況、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等情況的變化，至小花棘豆中毒典型癥狀出現(xiàn)模型復(fù)制結(jié)束。

1.4 臨床癥狀及病理學(xué)觀察

待試驗(yàn)小鼠出現(xiàn)小花棘豆中毒典型癥狀后，先稱其體重，然后斷頸處死，剖檢取心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和腦，稱量各臟器重量并計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)計(jì)算公式為臟器系數(shù)=(內(nèi)臟重/體重)×100%[3]。然后將臟器置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，間隔連續(xù)切片，HE染色，用Motic DMBA300-B數(shù)碼互動(dòng)顯微系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，并拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠臨床癥狀變化

對(duì)照小鼠試驗(yàn)期內(nèi)未見任何異常。攻毒后7 d試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)被毛蓬亂干燥，部分小鼠輕微跛行，精神沉郁；第21 d時(shí)部分試驗(yàn)小鼠采食量與飲水量開始下降，其中試驗(yàn)Ⅲ組最為明顯；第63 d時(shí)試驗(yàn)小鼠普遍消瘦，其中試驗(yàn)Ⅲ組尤為明顯，具體表現(xiàn)為中毒小鼠對(duì)外界反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降，頭部和四肢均出現(xiàn)神經(jīng)性震顫，其臨床癥狀與高超等[3]的報(bào)道一致。

2.2 剖檢變化

對(duì)照組小鼠無明顯眼觀病變。試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)為尸體消瘦，多處皮下結(jié)締組織呈膠樣浸潤(rùn)，內(nèi)臟器官顏色與正常對(duì)照有明顯差異，其中肝臟、腎臟均出現(xiàn)腫大、淤血等情況，肺臟與胸膜發(fā)生粘連，并有點(diǎn)狀出血，心臟出現(xiàn)炎性水腫，心包增厚，腹腔內(nèi)有少量腹水。

2.3 小鼠各臟器系數(shù)的變化

由表1可見，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)均極顯著高于對(duì)照(P <0. 01)；試驗(yàn)Ⅲ組肺臟系數(shù)極顯著高于對(duì)照(P <0. 01)，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組肺臟系數(shù)均顯著高于對(duì)照(P <0. 05)；試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組脾臟系數(shù)和腦系數(shù)均極顯著低于對(duì)照(P <0. 01)；試驗(yàn)Ⅲ組心臟系數(shù)顯著低于對(duì)照(P <0. 05)，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組心臟系數(shù)值低于對(duì)照組小鼠，但組間差異不顯著(P>0. 05)。表明中毒小鼠臟器系數(shù)的變化與小花棘豆采食量呈現(xiàn)出一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 小花棘豆對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(X±S)

2.4 病理組織學(xué)變化

對(duì)照小鼠各臟器均未見明顯的病理性變化。試驗(yàn)組小鼠肝臟有出血和炎性病灶，其中試驗(yàn)Ⅲ組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹破裂和空泡變性，并且胞質(zhì)染色變淡，部分細(xì)胞核有聚集現(xiàn)象。中毒小鼠腎小管和腎小球上皮細(xì)胞發(fā)生腫脹，并有不同程度壞死，細(xì)胞核脫落、溶解，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化。試驗(yàn)組小鼠心外膜明顯增厚，原有間質(zhì)壞死崩解，出現(xiàn)炎癥性變化，心肌纖維HE染不均勻，淡染部分纖維肌漿溶解，橫紋消失，呈空泡化；肺泡壁和支氣管黏膜上皮細(xì)胞空泡變性，胞核淡染，部分肺泡壁毛細(xì)血管充血，中毒嚴(yán)重小鼠出現(xiàn)肺泡壁斷裂和肺泡增大。試驗(yàn)組小鼠脾竇中有色素沉積，脾小梁發(fā)生斷裂、壞死，脾小結(jié)出現(xiàn)空泡化巨噬細(xì)胞。此外，試驗(yàn)組小鼠腦部病變極為明顯，最顯著的特征為小腦浦肯野細(xì)胞發(fā)生空泡變性，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)典型大空泡，另有部分神經(jīng)纖維消失，腦組織HE染色較正常組織變淡，還出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)元現(xiàn)象，浦肯野細(xì)胞大小及染色不一，胞漿內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小顆粒，有典型空泡，海馬區(qū)神經(jīng)纖維變短。

3 討論

將小花棘豆草粉分別按照1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的比例飼喂小鼠，攻毒小鼠陸續(xù)出現(xiàn)中毒癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁，反應(yīng)遲鈍，步態(tài)不穩(wěn)，后肢麻痹、抽搐等；剖檢發(fā)現(xiàn)中毒小鼠臟器均發(fā)生不同程度的病變。試驗(yàn)表明，中毒小鼠的臨床癥狀及剖檢結(jié)果與高超等[3]，宋麗等[4]，米克熱木等[5]和陳紹淑[7]等的研究一致，證明小花棘豆確有毒性能夠引起小鼠中毒。

臟器系數(shù)可反映有毒物質(zhì)對(duì)臟器組織的損害程度。從試驗(yàn)結(jié)果可知，小花棘豆中毒小鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和肺臟系數(shù)增大，腦系數(shù)、心臟系數(shù)和脾臟系數(shù)降低，與高超等[3]，宋麗等[4]和米克熱木等[5]的研究一致。其中肝臟系數(shù)增大可能是小花棘豆毒性成分誘導(dǎo)肝微粒體代謝酶所致；腎臟是機(jī)體極易受到損害的重要器官,其中腎臟腫大是中毒病的共同特征；中毒小鼠脾臟質(zhì)量降低，說明小花棘豆中毒可導(dǎo)致小鼠脾臟萎縮，即中毒小鼠發(fā)生免疫力減退。通過對(duì)小鼠各臟器系數(shù)方差分析，表明小鼠臟器損傷程度與小花棘豆的采食量密切相關(guān)。但臟器系數(shù)的變化只能說明動(dòng)物某個(gè)臟器受到損傷, 進(jìn)一步的分析需要進(jìn)行病理組織學(xué)方面的檢查。

圖1 小花棘豆致小鼠中毒的病理學(xué)變化

小花棘豆中毒的特征性病理變化為組織細(xì)胞的胞漿空泡變性[8]。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)小鼠發(fā)生小花棘豆中毒時(shí)，肝臟、腎臟、脾臟、神經(jīng)系統(tǒng)等組織細(xì)胞均發(fā)生不同程度的空泡變性，其中腦組織最為嚴(yán)重，小腦中腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和浦肯野細(xì)胞均發(fā)生明顯的空泡變性[9，10]。Bryan等[11]認(rèn)為腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和浦肯野細(xì)胞與動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等功能有關(guān)，因而小花棘豆中毒導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)失調(diào)與腦組織受到傷害密切相關(guān)。王帥等[12，13]研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒導(dǎo)致的細(xì)胞空泡變性與自由基引起的空泡變性相似，進(jìn)一步研究證實(shí)小花棘豆中毒可顯著降低小鼠機(jī)體抗氧化酶活性，導(dǎo)致機(jī)體自由基蓄積，致使中毒動(dòng)物細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解、嚴(yán)重時(shí)整個(gè)線粒體呈現(xiàn)大的空泡，與試驗(yàn)中小鼠小花棘豆中毒的病理學(xué)變化基本吻合；另外與肝臟、腎臟等器官相比，腦僅具有中等活性的抗氧化能力，極易受到自由基的影響，與試驗(yàn)中腦組織病變最為明顯相吻合。Novikoff等[14]研究發(fā)現(xiàn)雖然小花棘豆的主要毒性成分苦馬豆素代謝半衰期僅為20 h，但中毒動(dòng)物停止采食有毒植物后，其神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂仍會(huì)持續(xù)數(shù)天乃至數(shù)周。這可能與動(dòng)物腦組織的毒性物質(zhì)蓄積有關(guān)，但目前未被相關(guān)研究所證實(shí)。

雖然中毒小鼠肝臟、腎臟等器官均發(fā)生以空泡變性為主的病理變化，但仍存在一定的差異。肝臟病變部位集中在肝小葉，極可能與代謝過程中的N-糖基化有關(guān)；腎臟中近曲小管的病理變化較遠(yuǎn)曲小管明顯，可能與二者對(duì)鈉、鉀、氯等離子的不同吸收或排除程度有關(guān)；小花棘豆中毒可導(dǎo)致動(dòng)物糖代謝發(fā)生紊亂，其中大量的α-甘露糖作為異常代謝產(chǎn)物進(jìn)入脾臟，脾臟中的免疫細(xì)胞便對(duì)甘露糖發(fā)生捕獲和吞噬，而邊緣區(qū)是脾內(nèi)免疫細(xì)胞捕獲、識(shí)別、處理抗原和誘發(fā)免疫應(yīng)答的主要部位，所以脾臟病變以邊緣區(qū)和紅髓為主，尤其以巨噬細(xì)胞最為顯著，這也與Armien等[15]的報(bào)道一致。

從本試驗(yàn)結(jié)果來看，小花棘豆中毒可導(dǎo)致肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和肺臟系數(shù)增大，腦系數(shù)、心臟系數(shù)和脾臟系數(shù)降低，中毒小鼠肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、腦組織等發(fā)生以空泡變性為主要特征的病理學(xué)變化，而且隨著小花棘豆攝入量的增加，其劑量效應(yīng)也越明顯。

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