天然活性小分子物質(zhì)分離技術(shù)研究

姜 麗

(安徽理工大學(xué)，安徽淮南232000)

豐富多樣的植物、動(dòng)物資源是大自然對(duì)我們的饋贈(zèng)。從天然植物、動(dòng)物資源中尋找利于人們身體健康的保健品和新型藥品是現(xiàn)代植物化學(xué)的主要研究方向之一。據(jù)資料報(bào)道，在天然植物中具有藥理活性的化合物分子量基本在1 000 Da以下。如何將活性成分分離并鑒定其結(jié)構(gòu)則是進(jìn)一步開(kāi)展研究的基礎(chǔ)。天然產(chǎn)物活性小分子物質(zhì)的分離可分為經(jīng)典方法和色譜分離方法，其中經(jīng)典方法是色譜技術(shù)的基礎(chǔ)。

1 經(jīng)典方法

1.1 LLE法 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。大分子物質(zhì)如多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)解析依然是多糖研究中的難點(diǎn)，并且通過(guò)現(xiàn)代波譜學(xué)方法僅能解析出多糖大分子復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。小分子物質(zhì)如生物堿，不同類型的生物堿具有不同的母核結(jié)構(gòu)，相同的母核結(jié)構(gòu)又由于取代基或構(gòu)象不同而千差萬(wàn)別。因此，分子中的原子處于不同的化學(xué)環(huán)境中，使得天然化合物分子極性各異。根據(jù)這一特點(diǎn)，采用液相萃取法可以快速、準(zhǔn)確地將所需化合物按照極性大小劃段。相同的分離段中的化合物具有相同的極性，為進(jìn)一步分離、純化奠定基礎(chǔ)。

液相萃取(LLE)需要使用大量的有機(jī)溶劑，具有對(duì)環(huán)境不友好等缺點(diǎn)。近年來(lái)，出現(xiàn)了一種新型液相微萃取技術(shù)——濁點(diǎn)萃取法。濁點(diǎn)萃取原理是基于中性表面活性劑膠束溶液的濁點(diǎn)現(xiàn)象，通過(guò)改變?cè)囼?yàn)條件如溶液pH、離子強(qiáng)度、溫度等使得疏水性物質(zhì)和親水性物質(zhì)產(chǎn)生相分離［1－2］。這種方法安全高效、綠色環(huán)保，在很多領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。

1.2 SPE法 固相萃取(SPE)是利用固體吸附劑吸附混合液中目標(biāo)化合物，再利用洗脫液將其洗脫下來(lái)，達(dá)到分離、富集目標(biāo)物的一種手段。近年來(lái)，發(fā)展較快的新方法有基于萃取涂層與樣品之間的吸附—溶解—解吸平衡而建立起來(lái)的集進(jìn)樣、萃取、濃縮功能于一體的固相微萃取技術(shù)(SPME)［3］;萃取原理與 SPME 一致，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)套在內(nèi)封磁芯的玻璃管上作為萃取涂層的攪拌棒吸附萃取(SBSE)［4］;分子印跡固相萃取技術(shù)(MISPE)是使用人工合成的聚合物作為分子印跡聚合物，利用其對(duì)特定分子具有特異選擇性來(lái)提高萃取選擇性，該聚合物簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，對(duì)熱、有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等都比較穩(wěn)定［5］;免疫親和固相萃取(IASPE)是將醫(yī)學(xué)免疫與色譜技術(shù)融合，利用抗原抗體相互高度識(shí)別的特點(diǎn)將目標(biāo)化合物分離、濃縮。這種分離技術(shù)尤其適用于生物活性小分子的分離識(shí)別，如海洛因和嗎啡等生物堿類化合物［6－7］。

1.3 膜分離法 膜分離法的基本原理類似于“分子篩”，通過(guò)調(diào)整膜孔徑大小可分離不同分子大小的有機(jī)化合物，根據(jù)膜孔徑可將膜分離為超濾和納濾。膜分離技術(shù)不使用有機(jī)溶劑，操作過(guò)程中化學(xué)環(huán)境溫和環(huán)保，故在天然活性產(chǎn)物的分離篩選上將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用［8］。

1.4 沉淀法 沉淀法是利用有機(jī)化合物在溶劑中的溶解特點(diǎn)進(jìn)行分離的一種方法。最典型的應(yīng)用為采取水提醇沉法提取大分子多糖和蛋白質(zhì)。這種方法操作簡(jiǎn)單，過(guò)程溫和，環(huán)境友好，成本低廉，且適合處理大量樣品，目前已被廣泛使用。

2 色譜分離方法

色譜方法根據(jù)分離機(jī)制可分為吸附色譜、分配色譜、體積排阻色譜、離子交換色譜、親和色譜、化學(xué)鍵合相色譜、毛細(xì)管電色譜和毛細(xì)管電泳［9］，其中親和色譜主要用于分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子生化樣品，而毛細(xì)管電泳法在生命科學(xué)中應(yīng)用廣泛。天然產(chǎn)物化學(xué)中生物小分子分離主要使用的有MG大孔樹脂、Sephadexlh20、rp-8和正相硅膠色譜等。

2.1 大孔樹脂 大孔樹脂是人工合成的高分子化合物。它不溶于酸、堿或有機(jī)溶劑且對(duì)熱穩(wěn)定，可有效地對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行濃縮、分離。影響其吸附、分離效果的因素主要有樹脂結(jié)構(gòu)、化合物結(jié)構(gòu)和洗脫劑。在天然產(chǎn)物的分離提取中，大孔樹脂主要用來(lái)對(duì)化合物的極性、大小進(jìn)行劃段，為后續(xù)分離、純化工作做準(zhǔn)備。

2.2 凝膠色譜 凝膠色譜本質(zhì)上是一種體積排阻色譜。它具有“分子篩”功能，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部而大分子物質(zhì)被排阻開(kāi)來(lái)。在凝膠色譜中，Sephadexlh20在生物小分子分離純化中具有舉足輕重的地位。對(duì)于Sephadexlh20，相對(duì)分子質(zhì)量大于5 000的生物分子將隨流動(dòng)相直接流出而不被色譜柱保留，且這種凝膠不受溶劑系統(tǒng)限制，所以它特別適合生物堿、聯(lián)芐類、菲類、萜類等小分子活性物質(zhì)的分離制備，既可以用作初步劃段又可以用作最終的精制測(cè)定。

2.3 硅膠色譜 硅膠色譜不溶于任何溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，除強(qiáng)堿、氫氟酸外與任何物質(zhì)均成惰性，常用的規(guī)格有100～300目，目數(shù)不同，上樣量也不同，并且目數(shù)越細(xì)，上樣量越大，流速越小，但是耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。由于硅膠柱具有死吸附的特點(diǎn)，在使用過(guò)程中要注意把握時(shí)間和規(guī)格，以防止微量活性物質(zhì)損耗過(guò)大而分離不出來(lái)。

3 展望

在許多植物與中草藥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)眾多具有抗氧化、抗腫瘤、細(xì)胞毒性和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)藥理功效的小分子化合物如萜類和聯(lián)芐類。如何采用物理、化學(xué)、物理化學(xué)相結(jié)合、色譜等現(xiàn)代分離純化方法將它們溫和地提取分離出來(lái)是現(xiàn)代新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，也是新型保健品研制的關(guān)鍵點(diǎn)。安全高效、快速溫和的預(yù)處理技術(shù)如微萃取和物美價(jià)廉、環(huán)保高效的色譜技術(shù)如凝膠色譜將是天然活性小分子物質(zhì)分離技術(shù)的主要研究方向。

［1］吳昊.液相萃取新方法的建立和應(yīng)用［D］.臨汾:山西師范大學(xué)，2012.

［2］王堅(jiān)剛，林建原.濁點(diǎn)萃取技術(shù)的應(yīng)用［J］.廣東微量元素科學(xué)，2009，16(3):17－20.

［3］馬繼平，王涵文，等.固相微萃取新技術(shù)［J］.色譜，2002，20(1):16 －20.

［4］許志剛，胡玉玲.攪拌棒吸附萃取技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展，2011，39(11):1766 －1773.

［5］蔡亞岐，牟世芬.分子印跡固相萃取及其應(yīng)用［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2005，24(5):116－121.

［6］許莉.利用免疫親和固相萃取檢測(cè)小分子化合物的方法研究及其應(yīng)用［D］.北京:北京大學(xué)，2010.

［7］孫海紅，錢葉苗，等.固相萃取技術(shù)的應(yīng)用與研究新進(jìn)展［J］.現(xiàn)代化工，2011，31(2):21 －24.

［8］徐任生，趙維民，葉陽(yáng).天然產(chǎn)物活性成分分離［M］.北京:科學(xué)出版社，2012.

［9］杜斌，鄭鵬武.實(shí)用現(xiàn)代色譜技術(shù)［M］.鄭州:鄭州大學(xué)出版社，2009.