肉毒毒素重組抗原表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

付 強(qiáng)，莫 玲，苗立中，王 艷，李金林(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600)

肉毒中毒是由肉毒毒素(BoNTs)引起的一種致死性的神經(jīng)麻痹性疾病。肉毒毒素是革蘭氏陽(yáng)性的肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧環(huán)境下產(chǎn)生的一種外毒素。它是人類目前已知的毒素中毒力最強(qiáng)的毒素［1］，其毒性是氰化鉀的10 000倍，對(duì)人的最小致死量約為0.1 μg。根據(jù)毒素抗原性不同，肉毒桿菌分為7 型:A、B、C、D、E、F、G 型，其中引起人類疾病的是A、B、E和F型，以A型肉毒桿菌產(chǎn)生的毒素毒性最強(qiáng);C型和D型毒素主要引起畜禽和野鳥(niǎo)中毒。

各血清型BoNT的結(jié)構(gòu)基本相同，均是由輕鏈(LC)和重鏈(HC)2個(gè)亞單位靠二硫鍵相連組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，Hc為產(chǎn)生最佳免疫保護(hù)效果的最小毒素片段，是肉毒毒素疫苗研究的靶抗原。傳統(tǒng)類毒素疫苗需要培養(yǎng)大量肉毒梭菌來(lái)提取肉毒毒素，再經(jīng)甲醛(福爾馬林)滅活，制備過(guò)程安全性較低。隨著肉毒毒素表位及保護(hù)性抗原研究的深入，制備無(wú)毒性毒素保護(hù)性抗原片段(即重組毒素rHc片段)作為候選疫苗，會(huì)使疫苗安全性大大提高［2］。通過(guò)基因重組技術(shù)，能夠?qū)Hc片段在大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)，制備的疫苗免疫攻毒試驗(yàn)可獲得良好效果。

1 大腸桿菌表達(dá)肉毒毒素抗原

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可有效表達(dá)異源蛋白，具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)，多種活性蛋白通過(guò)此系統(tǒng)表達(dá)獲得，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域［3］。大腸桿菌表達(dá)外源蛋白有2種類型，可溶性和非可溶性(包涵體)，大多數(shù)研究人員更傾向于可溶性蛋白的表達(dá)，但存在易降解的缺點(diǎn)。

絕大多數(shù)肉毒重組抗原在大腸桿菌表達(dá)使用pET質(zhì)粒。這些質(zhì)粒攜帶T7啟動(dòng)子和pBR322復(fù)制原點(diǎn)，蛋白表達(dá)能力強(qiáng)但可通過(guò)降低誘導(dǎo)物的濃度來(lái)削弱蛋白表達(dá)，以提高某些目的蛋白的可溶部分產(chǎn)量。也使用T5啟動(dòng)子降低表達(dá)水平，從而增加了表達(dá)蛋白的可溶性，但此表達(dá)并非完全有效［4－5］。另外一種方法是使用融合標(biāo)簽，研究表明某些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其他易形成包涵體的蛋白質(zhì)融合后會(huì)促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)。例如，谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GST)［6］、硫氧還蛋白(TRX)［7］和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)［8］已被成功表達(dá)可溶性肉毒抗原，這些融合標(biāo)簽將為進(jìn)一步的蛋白濃縮、提純、檢測(cè)等提供便利，同時(shí)也可以有效抑制宿主蛋白酶的降解活性。

在規(guī)?；a(chǎn)中，需要通過(guò)工藝優(yōu)化來(lái)降低生產(chǎn)成本，傳統(tǒng)的LB肉湯、2YT和TB成分復(fù)雜不適合工業(yè)化生產(chǎn)。此外，肉湯培養(yǎng)基含有動(dòng)物源蛋白成分，增加了朊病毒的風(fēng)險(xiǎn)。選用M9培養(yǎng)基可用于肉毒抗原的生產(chǎn)［9－10］。培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)劑控制啟動(dòng)子誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，最常用的誘導(dǎo)劑為IPTG，使用濃度范圍約0.05～1.00 mmol/L，優(yōu)化濃度僅在很少情況下確定，關(guān)鍵在于誘導(dǎo)時(shí)間。搖瓶培養(yǎng)初始誘導(dǎo)濃度(OD600)為0.5～0.8，極少數(shù)使用高的濃度。然而，在高密度培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)時(shí)OD600在分批發(fā)酵為10～20，補(bǔ)料培養(yǎng)可達(dá)到90左右［10］。此外，在工程菌中需要添加抗生素，以維持菌體質(zhì)粒的穩(wěn)定，其添加量會(huì)對(duì)外源蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響。

溫度會(huì)影響菌體的代謝活性，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)。在蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)中，一般分為2個(gè)階段，菌體增殖階段一般為大腸桿菌的最適溫度37℃，極少數(shù)報(bào)道為30℃［11］，而在誘導(dǎo)表達(dá)階段溫度選取各研究報(bào)道差異較大，但大體可分為為3種類型:低溫(16～18℃)、中溫(25～30℃)、正常溫度(37 ℃)［10－12］，隨著培養(yǎng)方式的不同，蛋白誘導(dǎo)時(shí)間也有差異，從3 h到30 h不等。

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，菌體細(xì)胞需要處理以獲得純化的重組蛋白。當(dāng)前多使用帶多聚組氨酸標(biāo)簽(6×His－tag)的重組肉毒蛋白可以與Ni2+-NAT樹(shù)脂中的Ni2+螯合而得到快速純化。另外，離子交換、凝膠過(guò)濾等可結(jié)合親和色譜法進(jìn)一步純化。在揺瓶誘導(dǎo)過(guò)程可獲得1～220 mg/L的表達(dá)蛋白，優(yōu)化各發(fā)酵條件的高密度培養(yǎng)(HCDC)工藝可極大提高rBoNT產(chǎn)量，一般分批發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量為60 mg/L，但采用補(bǔ)料培養(yǎng)HCDC工藝，雖然表達(dá)時(shí)間僅有3 h，但rBoNT表達(dá)量達(dá)到468 mg/L［10］。

2 畢赤酵母表達(dá)肉毒毒素抗原

最早建立的用于外源蛋白生產(chǎn)的真核表達(dá)系統(tǒng)是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，但釀酒酵母不適合高密度培養(yǎng)，外源基因表達(dá)水平較低。并不是表達(dá)外源基因的理想宿主菌，Ogata等1969年首次發(fā)現(xiàn)1種嗜甲醇酵母——巴斯德畢赤酵母，其強(qiáng)有力醇氧化酶(AOX1)基因啟動(dòng)子，嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。在甲醇為唯一碳源的條件下生長(zhǎng)，可產(chǎn)生近30%的蛋白含量。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，已從最初用于畢赤酵母表達(dá)的野生型菌株NRRL-Y-11430改造衍生出多種用于外源蛋白表達(dá)的畢赤酵母菌株，如組氨酸缺陷型菌株GS115、KM71和MC100-3。

因?yàn)榧状季哂卸拘?、易燃，在食品和醫(yī)療領(lǐng)域中的使用受到限制，現(xiàn)已改造出多種不需要甲醇為唯一誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子，如GAP啟動(dòng)子和GCW14啟動(dòng)子［13］等，其表達(dá)量接近AOX1啟動(dòng)子。近年來(lái)，有學(xué)者應(yīng)用雙啟動(dòng)子策略可提高蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量。李紅亮等［14］應(yīng)用AOX1和GAP雙啟動(dòng)子共表達(dá)體系，人胰島素原在畢赤酵母中的表達(dá)量最高可達(dá)到單啟動(dòng)子表達(dá)量的5倍，但這些技術(shù)在肉毒蛋白表達(dá)方面還未見(jiàn)報(bào)道。

天然BONT的Hc片段基因中富含A－T堿基和稀有密碼子，通過(guò)降低A－T含量及同義密碼子置換人工合成Hc段基因(rHc)，以提高酵母菌表達(dá)量，是研究者采取共同的方法，外源DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母后，通過(guò)抗生素、營(yíng)養(yǎng)缺陷載體選擇陽(yáng)性重組酵母。例如，使用pHIL-D4表達(dá)載體，其包含HIS4的編碼序列以彌補(bǔ)GS115的缺失基因。另有研究者使用來(lái)自pPICZ家族(Invitrogen)的質(zhì)粒，依靠博來(lái)霉素(Zeocin)抗性來(lái)選擇［15－16］。

酵母可以表達(dá)外分泌型蛋白(如采用pPIC9K載體)，但經(jīng)過(guò)糖基化修飾過(guò)程，改變了重組毒素蛋白rBoNT的免疫原性，造成免疫失敗，有些研究者采用胞內(nèi)表達(dá)可溶性rBoNT方式［15－16］，但存在大批量破碎酵母細(xì)胞壁的問(wèn)題。此外，與大腸桿菌相比，畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)(9～74 h)［16］。

與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑IPTG相比，甲醛成本較低，在培養(yǎng)過(guò)程甲醇濃度一般0.2% ～1.1%，一般通過(guò)甲醇生物傳感器進(jìn)行甲醇濃度控制，但存在響應(yīng)延遲和不穩(wěn)定的問(wèn)題，也可根據(jù)溶氧變化來(lái)間接判斷甲醇(碳源)的利用情況。

關(guān)于畢赤酵母發(fā)酵蛋白的產(chǎn)量，據(jù)報(bào)道實(shí)驗(yàn)室表達(dá)水平為 2.5 g rBoNT/kgWCW(濕重)，中試產(chǎn)量為 1.6 g rBoNT/kg WCW［16］和 3 g rBoNT/kgWCW［17］。由于不同研究者采取的提取工藝及純化方法存在差異，其產(chǎn)量不能直接比較，僅作參考。

3 展望

上述表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的亞單位疫苗，經(jīng)過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)可獲得比較滿意的效果，研究表明添加佐劑如 AL(OH)3、LTB［18］、GPA［19］等或表達(dá)融合蛋白［15］均可以明顯提高亞單位疫苗的效果，但還存在以下問(wèn)題:①試驗(yàn)對(duì)象多以小鼠為模型動(dòng)物，少數(shù)為馬、牛等大型牲畜，臨床試驗(yàn)有待繼續(xù)研究。②大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)易產(chǎn)生內(nèi)毒素和包涵體，畢赤酵母表達(dá)的蛋白糖基化修飾過(guò)度、細(xì)胞壁裂解等問(wèn)題并未徹底解決。③肉毒毒素有7個(gè)血清型，不存在交叉保護(hù)，如何研制多價(jià)疫苗。除上述2種表達(dá)系統(tǒng)外，還有其他表達(dá)方法用于試驗(yàn)性研究，如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)［20］、塞姆利基森林病毒復(fù)制子(SFV)載體系統(tǒng)［21］、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)［22］。雖然已經(jīng)取得一定成果，但此表達(dá)系統(tǒng)成本較高，目前還不太適合工業(yè)化生產(chǎn)需要。相信隨著科學(xué)水平的進(jìn)步及各專業(yè)技術(shù)人員的共同努力，重組蛋白的表達(dá)及生產(chǎn)技術(shù)將取得更大進(jìn)步。

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