壽光雞中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒的分離鑒定及其env基因序列分析

王海燕 （山東省壽光市紀(jì)臺鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站 262722）

李志松 （山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局） 李志杰 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是禽類的一種重要的致腫瘤性疾病，其病原禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)是一個(gè)禽反轉(zhuǎn)錄病毒群，與禽白血病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)、馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)一樣是引發(fā)禽類發(fā)生腫瘤的常見病毒。REV不僅可以感染雞，還可以感染火雞、鴨、鵝、鵪鶉和野雞等[1]。

REV主要誘發(fā)雞急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、淋巴組織和其它組織的慢性腫瘤等。除腫瘤外REV還可導(dǎo)致感染禽類胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降等。禽通常可經(jīng)垂直傳播、水平傳播感染REV，但是通常使用了被REV污染的活疫苗也可以造成REV的感染，但這種情況很少出現(xiàn)腫瘤，僅呈現(xiàn)抗體陽性。近年來，我國不同雞群中REV的流行率有增高趨勢，特別是在地方品系雞中血清抗體陽性率增高極為明顯[2,3]，顯示在我國的一些地方品系雞中存在REV感染的巨大風(fēng)險(xiǎn)。本研究從山東省地方品系壽光雞中分離鑒定了3株REV并對其env基因進(jìn)行了測序分析。

1 材料與方法

1.1 病料來源與背景 2013年10月山東濰坊壽光某雞場飼養(yǎng)的商品代壽光雞發(fā)生腫瘤病例，剖檢可見肝臟和脾臟有腫瘤，隨機(jī)抽取100只雞翅靜脈采血，分離血清后分別用Avian Leukosis Virus Antibody Test Kit(ALV-A/B), Avian Leukosis Virus Antibody Test Kit-Subgroup J (ALV-J), Reticuloendotheliosis Virus Antibody Test Kit(IDEXX Laboratory, USA)按照說明書檢測REV和ALV血清抗體，有39份血清樣品顯示REV抗體陽性。懷疑本雞群存在REV感染。

1.2 病毒的分離鑒定 從雞群中隨機(jī)抽取10只雞，每只雞均無菌靜脈采集抗凝血1ml，1500r/min，離心2min后取血漿接種于已長成單層的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中提前放入滅菌的細(xì)胞爬片。接種后細(xì)胞在37℃孵育1h后棄掉培養(yǎng)液，更換為含1%新生牛血清(GIBCO，USA)的DMEM維持液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)8d。盲傳1代維持7d后收集培養(yǎng)上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?，培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片以丙酮與乙醇冰(3:2)混合液固定5min。然后分別以針對ALV-J的單克隆抗體、馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)單克隆抗體、REV單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)檢測。最后加一滴50%甘油于蓋玻片上，在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]。

1.3 分離毒株env基因的擴(kuò)增、克隆和測序 CEF在接種REV維持6d后收獲細(xì)胞，經(jīng)洗滌、離心沉淀再用抽提緩沖液(100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl pH 8.0, 25mmol/L EDTA pH 8.0, 0.5%SDS)懸浮后，加入蛋白酶K(100ug/ml)消化過夜，再用苯酚抽提和乙醇沉淀后，溶解于TE(10mmol/L Tris-Cl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)中即為樣品模板DNA(50～100ng/μl)。參照已發(fā)表的文獻(xiàn)合成了一對引物用于擴(kuò)增分離毒株的env基因[5]。反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)配置，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃，60s.55℃，50s,72℃，2min；33個(gè)循環(huán)；72℃,10min。以正常CEF基 因組DNA作為陰性對照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳鑒定并將目的條帶切下以E.Z.N.A Gel Extraction Kit (OMEGA, USA)回收純化DNA，將純化DNA連接PMD-18T Vector(TaKaRa，大連)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，隨機(jī)挑取菌落以Plasmid Mini Kit(OMEGA，USA)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，選取鑒定為陽性克隆子送上海生工生物工程有限公司測序，序列以DNAStar軟件進(jìn)行分析。為了分析所分離毒株的分子演化趨勢，選取了來源于雞、鴨、鵝等不同物種的REV參考毒株的env基因進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析，參考毒株及GenBank登錄號見表1。

表1 用于env氨基酸序列比較所用REV參考株及其GenBank登錄號

2 結(jié)果

2.1 REV的分離鑒定 IFA檢測結(jié)果表明有3份樣品顯示REV陽性，與未感染的樣品相比，陽性樣品的胞質(zhì)內(nèi)均有明顯的特異性綠色熒光，細(xì)胞核未被染色呈現(xiàn)灰暗色(圖1)；而MDV和ALV均為陰性。分離到的REV命名為SD1301、SD1302和SD1303。

2.2 REV分離株env基因的克隆測序與序列分析 以SD1301、SD1302和SD1303感染后細(xì)胞總DNA為模板，用PCR均擴(kuò)增出了約2kb左右的清晰條帶，與預(yù)期目的片段相符；陰性對照未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。對3個(gè)陽性樣品的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，SD1301、SD1302和SD1303三個(gè)毒株的env基因全長均為1761bp，編碼587個(gè)氨基酸，3株REV之間env基因的核酸同源性為100%；與7株不同參考株序列比較顯示與近年來分離自中國黑龍江的HLJR0901親緣關(guān)系最近(圖2、圖3)，處于進(jìn)化樹上同一分支。

圖1 IFA檢測感染細(xì)胞中的REV感染

3 討論

REV既可水平傳播又可以垂直傳播，但以垂直傳播為主。由于REV的宿主范圍和傳播途徑特點(diǎn)使得REV迅速傳播到世界各地，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。此外，在禽用弱毒疫苗如雞痘病毒疫苗中污染REV引起的REV爆發(fā)案例也時(shí)有報(bào)道并會引起諸多糾紛[6]。近年來，我國雞群中REV的血清抗體陽性率逐漸增高，特別是在地方品系雞中尤為嚴(yán)重[2,3]，并且REV與其它雞免疫抑制性病毒的混合感染也比較普遍[7-9]。本研究即從山東省地方品系雞中分離到定了3株REV，顯示地方品系雞中REV的感染仍然是不容忽視的問題之一。

圖2 分離REV與參考毒株env氨基酸同源性

圖3 以env基因WFSG1301和WFSG1302與不同REV 參考毒株的進(jìn)化關(guān)系

在REV的各基因中，編碼囊膜蛋白的env基因相對變異較快。通常人們通過對不同毒株env基因的序列分析來顯示REV的分子進(jìn)化。然而對本研究分離的3株REV進(jìn)行env基因序列的測定和分析顯示，3株REV之間的env基因之間竟然同源性為100%，并且他們與Chicken/3337/05(分離自中國臺灣)、APC-566(分離自美國)、FA(分離自美國)、Goose/3410/06(分離自中國臺灣)、HLJR0901(分離自中國黑龍江)等多個(gè)參考毒株也有高達(dá)99.9%的同源性，綜合考慮這些參考毒株的分離地區(qū)及其年份，推測上述3株REV分離株與分離自東北地區(qū)的HLJR0901等毒株可能有共同的來源，當(dāng)然不排除另一種可能，那就是都使用了同樣污染有REV的疫苗。

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