雞感染多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌的分離鑒定

朱貴霞 楊樹美 （山東省蒙陰縣畜牧局 276200）

巴氏桿菌病(P.multocida)和大腸桿菌病(E.coli)是危害養(yǎng)禽業(yè)的兩大細菌性傳染病，由特定血清型的致病菌引起[1]。雞群感染兩種細菌時均可引起嚴重下痢和敗血性癥狀，若兩菌同時感染時其致病力會大大加強，更易引起雞群呈急性敗血性發(fā)病[2]。巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的細菌性傳染病，對禽類的致病性較強，又稱為禽霍亂、禽出血性敗血病，俗稱為禽出敗[3]。該病發(fā)生后，同種畜禽間能互相傳染，不同的畜禽種間亦可交叉感染。本菌對多種家畜、家禽、野獸、野生水禽及人均有致病性。可使牛、水牛、羊、馬等發(fā)生出血性敗血癥；使雞、鴨、鵝等發(fā)生禽霍亂；使豬發(fā)生豬肺疫性肺炎等[4]。多殺性巴氏桿菌病分布廣泛，世界各地均有發(fā)生[5]。大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌的某些血清型引起的，血清型眾多，對動物的致病性強弱也不等，臨床表現(xiàn)復(fù)雜[6]。該病可引起雞胚胎死亡，或雛雞和幼雞死亡率很高的敗血癥，以及臍炎、關(guān)節(jié)炎、眼球炎、出血性腸炎及大腸桿菌性肉芽腫等多種病型的疫病[7]。大腸桿菌病流行分布極為廣泛和普遍，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。 本研究通過對某地一雞群病死雞進行細菌的分離鑒定，并進行毒力試驗和藥敏試驗，為該病的臨床診斷和治療提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 某雞場病死雞約650只，從青年雞到雛雞均有發(fā)病、死亡，死亡呈急性。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、血清營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制。

1.1.3 試驗動物 健康小鼠24只，體重18～20g，購自聊城市動物疾病研究中心。1日齡健康雛雞24只購自某種雞場。

1.1.4 微量糖發(fā)酵管、抗原診斷因子血清 微量發(fā)酵管購自上海醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠；大腸桿菌O抗原診斷因子血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.5 藥敏紙片 藥敏紙片—四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、狀觀霉素、強力霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、單諾沙星、復(fù)方新諾明、羧芐青霉素、氨芐青霉素、磺胺異惡唑和頭孢氨芐西林購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病情況 某雞場4300只雞，分4批次，每群有1000余只雞，從青年雞到雛雞不同日齡。青年雞首先發(fā)病，其余3批隨后也發(fā)病，發(fā)病數(shù)隨時間呈遞增狀態(tài)，1周時間共死亡650只雞；病雞主要表現(xiàn)精神沉郁，羽毛雜亂蓬松，兩翼下垂，縮頸低頭，俯臥在地，不愿走動，離開群體獨自閉目打盹，下痢，糞便稀呈綠白色；病程短，一般發(fā)病至死亡不超過24h。病死雞剖檢約有70%呈敗血癥狀，廣泛性出血，腹腔有大量黃色干酪樣物質(zhì)；肝臟腫大、充血、壞死；脾臟腫大、淤血、有壞死灶；胰臟有出血點、有壞死灶；心包積液，有炎癥；腸道黏膜脫落、出血、壞死；腺胃、腦無異常。

1.2.2 分離病菌 無菌取病雞的肝、脾和胰組織，分別接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、綿羊鮮血營養(yǎng)瓊脂，分別置37℃培養(yǎng)箱和5%CO2的培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)24h。

1.2.3 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性 取初次分離及純培養(yǎng)的細菌涂片、染色、鏡檢，然后觀察分離菌在不同培養(yǎng)基的生長情況及菌落情況。

1.2.4 生化反應(yīng)及血清型鑒定 從每群雞分離到的細菌中選取具有代表性的疑似大腸桿菌和疑似巴氏桿菌各2株，共16株純培養(yǎng)物，分別編號為D1、D2……D8和B1、B2……B8。將純培養(yǎng)菌分別接種于生化反應(yīng)管和微量發(fā)酵管等，按常規(guī)生化試驗進行，37℃培養(yǎng)一定時間。具體操作步驟按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版方法進行，按說明進行判定[8]。

1.2.5 增菌純培養(yǎng) 對生化試驗鑒定為大腸桿菌的菌株，無菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃培養(yǎng)箱20h。對生化試驗鑒定為巴氏桿菌的菌株，無菌接種血液瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，于5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h。

1.2.6 藥敏試驗(紙片法) 以分離菌的液體培養(yǎng)物適當稀釋接種培養(yǎng)基，用無菌尖頭鑷子夾取各種抗菌素藥敏試紙片，按一定密度分別貼到已涂布細菌的培養(yǎng)基表面，倒置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，分別測定抑菌圈的直徑。

1.2.7 動物試驗 用分離菌的肉湯培養(yǎng)物適當稀釋大腸桿菌純培養(yǎng)物、巴氏桿菌純培養(yǎng)物、大腸桿菌純培養(yǎng)物和巴氏桿菌純培養(yǎng)物混合物及無菌肉湯制成菌懸液，接種試驗動物。試驗動物分4組，每組12只，皮下注射0.2ml/只。連續(xù)觀察120h，記錄發(fā)病及死亡情況和剖檢死亡動物，同時取其肝臟觸片，美藍染色鏡檢。另采樣接種培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)后，革蘭氏染色，觀察純培養(yǎng)物。

1.2.8 大腸桿菌血清型試驗 分離的菌種用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)并經(jīng)120℃2.5h處理后，與鑒定用大腸桿菌標準抗O因子血清(A-F群)做平板凝集試驗，以鑒定其群別。H抗原一般不作鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)和鏡檢

無菌分別接種普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，24h后觀察。普通營養(yǎng)瓊脂上只有一種菌落，呈圓形，微隆起，光滑，濕潤，半透明或灰白色，邊緣整齊，菌落直徑2.5mm。麥康凱培養(yǎng)基中只見一種紅色菌落，形態(tài)與上述菌落相似。鮮血培養(yǎng)基上有2種形態(tài)菌落，一種與上述菌落相似并且呈β溶血，每群雞選取具有代表性的菌落2株，共8株菌落，編號為D1、D2……D8。革蘭氏染色鏡檢均為G-桿菌。鮮血培養(yǎng)基上還有另一種菌落呈小水滴樣，光滑透明，不溶血，菌落較小，培養(yǎng)48h后菌落變大一些，每群雞選取具有代表性的菌落2株，共8株菌落，編號為B1、B2……B8。接種普通培養(yǎng)基均不生長，麥康凱培養(yǎng)基均不生長，革蘭氏染色鏡檢均為G-桿菌，美藍染色鏡檢，可見兩極濃染小球桿菌。其純培養(yǎng)菌落在光學(xué)顯微鏡45°熒光觀察，呈桔紅色。

2.2 生化鑒定

將分離的16株純培養(yǎng)菌做生化反應(yīng)試驗，結(jié)果見表1和表2。

表1 D1-D8株分離菌生化特性反應(yīng)結(jié)果

表2 B1-B8株分離菌生化特性反應(yīng)結(jié)果

生化反應(yīng)試驗結(jié)果表明：D1、D2……D8菌落均能使三糖鐵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、底呈黃色，確認均為同一種大腸桿菌，以下稱為D菌[9]；B1、B2……B8菌落均能使三糖鐵試驗底部發(fā)黃，可確認是多殺性巴氏桿菌，以下稱為B菌[10]。

2.3 血清型

大腸桿菌血清型試驗結(jié)果表明，D菌為O26血清型大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗

用16種藥敏片分別對D菌和B均進行藥敏試驗，根據(jù)北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準，兩種菌均對恩諾沙星、單諾沙星和頭孢氨芐西林高敏，對其余藥物中敏或低敏。

2.5 動物試驗

大腸桿菌組有1只小白鼠120h死亡，巴氏桿菌組實驗動物24～48h全部死亡，混合組實驗動物24h全部死亡，對照組動物沒有死亡。剖檢病死動物采取臟器進行細菌分離，獲得與原分離菌株一致的小桿菌。

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，觀察病癥，剖檢、觀察病理變化，采集病料進行實驗室診斷，確診為雞多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌混合感染。動物致病試驗說明，多殺性巴氏桿菌對雞和小白鼠有較強的致病性，大腸桿菌對雞和小白鼠的致病性稍低，若大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌兩菌同時感染雞和小白鼠，其致病性最強，病程最短，死亡最快。

本病的綜合防治主要是藥物治療和疫苗預(yù)防，用于治療大腸桿菌病和巴氏菌病的藥物較多，但由于這兩種菌的致病性菌株多，對藥物敏感不一致，經(jīng)常使用一種藥物會產(chǎn)生耐藥性。本研究藥敏試驗結(jié)果可見，針對病菌的敏感藥物較少，應(yīng)首選高敏藥物進行治療，為避免同一藥物連續(xù)使用，采取“輪換”或“交替”用藥方案，同時用藥劑量要充足，以減少抗藥菌株的產(chǎn)生。目前這兩種禽病疫苗免疫效果都不夠理想，由于血清型較多，菌苗使用有一定的局限性。最好是從本區(qū)域病死雞上分離出菌株，制成疫苗用于當?shù)氐念A(yù)防，免疫效果則良好[9]。

本病的發(fā)生經(jīng)常是由于一些不良外界因素造成，做好平時的飼養(yǎng)管理工作，使家禽保持較強的抵抗力是預(yù)防本病的最關(guān)鍵措施。為了預(yù)防本病的發(fā)生，建議該雞 場以后應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，搞好清潔衛(wèi)生，發(fā)現(xiàn)病禽及時隔離，將禽舍和設(shè)備清洗干凈，并徹底消毒[10]，進而避免或杜絕引起發(fā)病的誘因，大大減少發(fā)病或不發(fā)病。此外，每年定期進行預(yù)防接種。

[1]卡尼爾克BW,禽病學(xué)(第10版)[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999.

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