EGR-1及MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義

林杰，賴志文，林潔，徐慶，冉旭

(自貢市婦幼保健院遺傳生殖中心，四川自貢643000)

EGR-1及MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義

林杰，賴志文，林潔，徐慶，冉旭

(自貢市婦幼保健院遺傳生殖中心，四川自貢643000)

目的研究早期生長反應(yīng)基因-1(EGR-1)與金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)情況及臨床意義。方法收集45例2014年5月至2015年3月于四川省自貢市婦幼保健院確診的子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜，同期收集30例非子宮內(nèi)膜異位癥患者的正常內(nèi)膜組織。通過免疫組化二步法對三種內(nèi)膜組織中EGR-1、MMP-9的表達(dá)情況進行分析。結(jié)果EGR-1在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜(84.44%)與在位內(nèi)膜(73.33%)腺上皮細(xì)胞中的陽性檢測率顯著高于正常內(nèi)膜組(40.0%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；而不同內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中EGR-1的陽性檢出率異位內(nèi)膜為48.89%，在位內(nèi)膜為44.44%，正常內(nèi)膜為43.33%，三者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(在位內(nèi)膜88.89%、異位內(nèi)膜64.44%)及間質(zhì)細(xì)胞(在位內(nèi)膜66.67%、異位內(nèi)膜42.22%)中MMP-9的陽性檢出率均顯著高于正常內(nèi)膜組(腺上皮細(xì)胞33.33%、間質(zhì)細(xì)胞16.67%)，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且異位內(nèi)膜組顯著高于在位內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論檢測EGR-1、MMP-9的表達(dá)可用于判斷子宮內(nèi)膜異位癥的侵襲轉(zhuǎn)移和評估預(yù)后。

早期生長反應(yīng)基因-1；金屬基質(zhì)蛋白酶-9；子宮內(nèi)膜異位癥；免疫組織化學(xué)；表達(dá)；臨床意義

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)簡稱內(nèi)異癥，是一種臨床常見的婦科疾病，但其發(fā)生機制目前仍尚未明確。相關(guān)研究表明，子宮內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流至腹腔，經(jīng)過粘附、侵襲及形成新生血管等過程提供了異位內(nèi)膜成長的必要條件。子宮內(nèi)膜異位癥與惡性腫瘤表型侵襲能力的相似，二者可能存在共有的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。金屬基質(zhì)蛋白酶9(matrix metallo proteinase，MMP-9)是金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metallo Proteinase，MMPS)家族中分子量最大的明膠酶。目前研究認(rèn)為MMP-9在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位粘附、種植和生長的過程中發(fā)揮了重要作用[2]。而研究發(fā)現(xiàn)，早期生長反應(yīng)基因-1 (early growth response gene-1，EGR-1)可上調(diào)MMP-9表達(dá)，是促進腫瘤細(xì)胞粘附和侵蝕的重要轉(zhuǎn)錄因子[3]，但EGR-1在脫落的內(nèi)膜細(xì)胞種植過程中中是否發(fā)揮同等重要的作用，還有待進一步的確定。本研究旨在探討EGR-1、MMP-9與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料實驗組共采集得到45份異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜，采集對象為2014年5月至2015年3月期間在自貢市婦幼保健院婦產(chǎn)科住院手術(shù)的患者?；颊吣挲g23～45周歲，平均32.5歲。其中，在位內(nèi)膜增生期和分泌期患者分別為39例與6例。對照組選取同期在本院因其他原因進行手術(shù)治療但子宮內(nèi)膜正常的30例非EMs患者，年齡31～47周歲，平均37.4歲，其中增生期22例，分泌期8例。EMs與非EMs患者月經(jīng)周期均表現(xiàn)正常，且近3個月內(nèi)未使用過任何激素類藥物。同時排除患有多囊卵巢綜合征、甲狀腺疾病、糖尿病等異常情況。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集在手術(shù)過程中分別收集卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者的囊壁組織、在位內(nèi)膜組織及對照組正常子宮內(nèi)膜，立即進行多聚甲醛固定、石蠟包埋，最終經(jīng)病理醫(yī)師檢查證實。對于非全子宮切除的患者，需征得知情同意。手術(shù)過程中通過取內(nèi)膜器直接采集患者子宮內(nèi)膜。

1.2.2 免疫組化檢測本研究采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept Avidin-Biotin Complex，SABC)法進行免疫組化分析，EGR-1、MMP-9多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，SABC三步法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作步驟詳見說明書。實驗過程中陽性對照為已知的陽性乳腺癌切片，陰性對照組一抗以PBS代替。

1.2.3 結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)通過雙盲法建立具體的評分標(biāo)準(zhǔn)。每張切片隨機選取10個代表性高倍視野進行觀察，并記錄每個視野下100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒即可判定為陽性細(xì)胞)的數(shù)量，結(jié)果以平均值表示。評分標(biāo)準(zhǔn)及對應(yīng)關(guān)系詳見表1。最終以染色強度和染色細(xì)胞所占面積的積分之和作為判別陰性和陽性依據(jù)。若積分和為0，則判定記過為陰性(-)；若積分和為1～2，則判定結(jié)果為弱陽性(+)；同理，積分和為3～4、5～6分別判定結(jié)果為陽性(++)和強陽性(+++)。

表1 染色強度與染色細(xì)胞所占面積評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用秩和檢驗；EGR-1與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性則采用Spearman相關(guān)性分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGR-1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)如圖1中A、B、C所示，EGR-1由腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)。EGR-1在異位內(nèi)膜腺細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜腺細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內(nèi)膜腺細(xì)胞中EGR-1的表達(dá)量明顯高于在正常內(nèi)膜腺細(xì)胞中的表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；不同內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中EGR-1的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中腺上皮細(xì)胞EGR-1的表達(dá)顯著高于間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)；而正常內(nèi)膜中間質(zhì)細(xì)胞EGR-1的表達(dá)略高于腺上皮細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組中EGR-1的表達(dá)統(tǒng)計情況見表2。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中EGR-1、MMP-9蛋白免疫組化染色結(jié)果(×200)

表2 EGR-1在不同子宮內(nèi)膜中的表達(dá)(例)

2.2 MMP-9在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá)如圖1中D、E、F所示，MMP-9的表達(dá)分布于腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MMP-9在異位內(nèi)膜腺細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜腺細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內(nèi)膜腺細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)量明顯高于正常內(nèi)膜腺細(xì)胞，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；此外，MMP-9在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)量明顯高于在正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同一內(nèi)膜中，MMP-9在腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于間質(zhì)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組內(nèi)膜中MMP-9的表達(dá)情況見表3。

表3 MMP-9在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)(例)

2.3 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中EGR-1、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中EGR-1、MMP-9表達(dá)的相關(guān)系數(shù)分別為0.876和0.812(P均＜0.01)。而在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中EGR-1、MMP-9表達(dá)的相關(guān)系數(shù)分別為0.969和0.934(P均＜0.01)。二者在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)均顯著相關(guān)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種較常見的婦科疾病，病理表現(xiàn)主要為子宮內(nèi)膜組織生長于子宮腔外，如子宮肌層、卵巢或盆腔內(nèi)的其他部位。此外，患者還常伴有月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)甚至不孕等癥狀。而目前其發(fā)病機制仍未完全明確，即使是此前較公認(rèn)的子宮內(nèi)膜種植學(xué)說也無法合理闡釋90%左右婦女在月經(jīng)來潮時存在經(jīng)血逆流，EMs的發(fā)生率卻不足15%等臨床表現(xiàn)。近年來，“在位內(nèi)膜決定論”的觀點被大眾所接受，該理論指出，在位內(nèi)膜對于EMs的發(fā)生具有關(guān)鍵性作用[4]。

EGR-1屬于即刻早期基因家族的一員，可參與細(xì)胞的生長、增殖以及凋亡等多種生理過程。其表達(dá)受有絲分裂原、生長因子、細(xì)胞因子、缺氧、雌激素等因素介導(dǎo)[5]。相關(guān)研究表明，EGR-1可參與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖[6]。而本研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中EGR-1的表達(dá)量明顯高于正常內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，表明EGR-1在異位內(nèi)膜中的過高表達(dá)可能與異位病灶種植后的生長與發(fā)展相關(guān)。而EGR-1在在位內(nèi)膜與正常內(nèi)膜之間存在的表達(dá)差異，表明在位內(nèi)膜在經(jīng)血逆流時可能更容易發(fā)生異位種植。

此外，大量的研究結(jié)果表明，依賴于脫落細(xì)胞的粘附作用，在足夠的血液供給情況下，脫落的子宮內(nèi)膜成功粘附并種植在腹膜或組織器官上。本研究推測，受到EGR-1正向調(diào)控的MMP-9可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽和新生血管形成，促使異位內(nèi)膜得以種植生長并不斷擴大，從而在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位粘附、種植和生長的過程中發(fā)揮了重要作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯高于對照組，據(jù)此推測異位內(nèi)膜中MMP-9高表達(dá)可提高異位存活能力，并促成病灶的進一步發(fā)展。而在本研究中，MMP-9在在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對照組，這與Matsuzaki等[8]研究結(jié)果存在一致性，也與“在位內(nèi)膜決定論”的觀點相近。同時，本研究結(jié)果表明子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)量顯著高于其在在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，分析其原因可能受腹腔微環(huán)境差異的影響，使得缺氧情況在異位內(nèi)膜中表現(xiàn)更為嚴(yán)重，而為適應(yīng)缺氧的條件，EGR-1正向調(diào)控MMP-9表達(dá)的機制被激活，從而改善了血管生成的能力[5]。

本研究通過免疫組化法分析了內(nèi)異癥患者的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中EGR-1、MMP-9的表達(dá)情況。結(jié)果表明，EGR-1、MMP-9在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的高表達(dá)與EMs的發(fā)病機制密切相關(guān)，進一步的分析將有助于判斷子宮內(nèi)膜異位癥的侵襲轉(zhuǎn)移及評估預(yù)后。

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Expression of EGR-1,MMP-9 in endometriosis of ovary and its clinical significance.

LIN Jie,LAI Zhi-wen,LIN Jie,XU Qing,RAN Xu.Department of Genetic and Reproductive Medicine Center,Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital,Zigong 643000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of early growth response gene-1(EGR-1)and matrix metallo proteinase-9(MMP-9)protein in the ectopic and eutopic endometrium in endometriosis(EMs)patients and its clinical significance.MethodsThe expression of EGR-1 and MMP-9 protein in ectopic and entopic endometrium tissues from 45 patients with EMs and endometrium tissues from 30 patients with normal endometrium in Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital from May 2014 to March 2015 were detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of expression of EGR-1 in glandular cell in ectopic(84.44%)or eutopic endometrium(73.33%)of the patients with EMs were significantly higher than that in control group(40.0%)(P＜0.05),but no significant difference between ectopic and eutopic endometrium was found(P＞0.05).There were no significant differences in the positive expression rate of EGR-1 in stromal cells in ectopic endometrium(48.89%),eutopic endometrium(44.44%)or normal endometrium(43.33%)(P＞0.05);The positive expression rate of MMP-9 in glandular and stromal cells in ectopic (glandular cells 88.89%,stromal cells 66.67%)or eutopic endometrium(glandular cells 64.44%,stromal cells 42.22%)of the patients with EMs were significantly higher than those in control group(glandular cells 33.33%,stromal cells 16.67%) (P＜0.01),and the positive expression rate in ectopic endometrium were significantly higher than in that in eutopic endometrium(P＜0.05).ConclusionThe expression of EGR-1 and MMP-9 in ectopic and eutopic endometrium may play an important role in the invasion of endometriosis and metastasis of EMs as well as evaluation of prognosis.

Early growth response gene-1;Matrix metallo proteinase-9;Endometriosis;Immunohistochemistry;Expression;Clinical significance

R711.74

A

1003—6350（2017）07—1101—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.025

2016-10-10)

林杰。E-mail：727064716@qq.com