中華蟾蜍登陸后消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)和分布密度的增齡變化

汪寅，汪子怡，劉溯源，伍亮，陳頤佳，張志強

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物科學(xué)系，3安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)系，合肥 230036）

兩棲動物幼體水生生活，成體登陸生活，生活史過程不但經(jīng)歷了水陸環(huán)境的轉(zhuǎn)換，也涉及內(nèi)部器官萎縮、重建和改造等過程[1]。其中，變態(tài)前后消化器官的大小具有可塑性[2]，消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的出現(xiàn)時序、分布位置和密度也隨變態(tài)過程而波動，具有物種特異性[3-7]。嗜銀細(xì)胞是消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的總稱，廣泛分布于各類無脊椎動物和脊椎動物[8-9]。兩棲動物成體嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征受季節(jié)、冬眠狀態(tài)或饑餓等因素的影響較小，但分布位置和密度變幅較大[10]。目前，對登陸后不同年齡階段兩棲動物消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)和分布密度的比較研究，只見于花背蟾蜍（Pseudepidalea raddei）[11]。本文采用Grimelius銀染法結(jié)合微波改良技術(shù)[12]，比較了幼體、亞成體和成體雄性中華蟾蜍（Bufo gargarizans）消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，以及同一年齡組嗜銀細(xì)胞分布密度的部位差異、同一部位嗜銀細(xì)胞分布密度的年齡差異，為中華蟾蜍消化生理學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗材料

于2018年7月中下旬在安徽省合肥市包河區(qū)大圩鎮(zhèn)曉南村（117.38°E、31.76°N）池塘中捕捉中華蟾蜍，分別捕獲成體、亞成體和幼體雄蟾各8只，暫養(yǎng)于塑料箱（40 cm × 50 cm × 90 cm）內(nèi)不超過24h。第二天，用電子天平稱量動物的體重（±0.001 g），直尺測量體長（± 0.1 cm）。幼體的體重為（8.763 ± 0.945）g，體長為（4.6 ± 0.1）cm；亞成體的體重為（21.325 ± 0.392）g，體長為（6.3 ±0.1）cm；成體的體重為（70.425 ± 5.089）g，體長為（8.9 ± 0.2）cm。之后用雙毀髓法處死動物，解剖分離消化道，并去除內(nèi)容物，截取0.3～1cm 長的食道、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸各段組織，固定于10%的中性甲醛溶液48h以上，蒸餾水水洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用輪轉(zhuǎn)切片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號：KD-2258）切片厚5μm。

2 結(jié)合微波技術(shù)的Grimelius嗜銀細(xì)胞染色法

參照伍亮等[11]對花背蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的染色方法，結(jié)合微波處理技術(shù)[12]，對不同年齡組中華蟾蜍消化道各段進行銀染處理。其基本過程如下：石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇處理脫蠟至水后浸入1%的硝酸銀水溶液，在微波爐（Media EP210）中中火加熱5min，溫度保持為58～60℃，之后用60℃的蒸餾水清洗銀染后的切片，并轉(zhuǎn)入已60℃預(yù)熱0.5h新鮮配制的還原液中，在微波爐中還原5min后，自來水充分沖洗切片3min，去除附著在切片上的殘留物，終止還原反應(yīng)，再經(jīng)蒸餾水水洗5min后，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37℃烘干后，鏡檢觀察。

3 嗜銀細(xì)胞計數(shù)與拍照

使用Motic-BA 210型顯微鏡進行觀察、計數(shù)和拍照，顯微鏡放大倍數(shù)為400 ×。每只幼體中華蟾蜍食道、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸等部位都隨機選取1張切片，每張切片隨機計數(shù)3個400 ×視野，以3個視野中嗜銀細(xì)胞數(shù)量的平均值表示每一部位嗜銀細(xì)胞的分布密度，取8只幼體的平均值表示幼體該部位嗜銀細(xì)胞的分布密度。亞成體和成體嗜銀細(xì)胞分布密度的計數(shù)方法同幼體。

4 統(tǒng)計分析

用SPSS 19.0 for Windows進行數(shù)據(jù)處理。用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）統(tǒng)計不同年齡組和消化道不同部位嗜銀細(xì)胞分布密度的組間差異及年齡和部位的交互作用。用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及多重比較（Multiple comparisons）post hoc test統(tǒng)計幼體、亞成體和成體中華蟾蜍消化道不同部位嗜銀細(xì)胞分布密度的差異，以及不同年齡組消化道同一部位嗜銀細(xì)胞分布密度的差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

結(jié) 果

1 消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

閉合型或開放型細(xì)胞都主要分布于消化道粘膜上皮和腺體中。閉合型嗜銀細(xì)胞呈圓形或橢圓形，幼體主要分布于食道（圖1A）和胃底（圖1B），幽門（圖1C）、十二指腸（圖1D）、空腸和回腸偶見；亞成體十二指腸（圖1E）和胃底（圖1F）數(shù)量較多，幽門（圖1G）和回腸（圖1H）偶見；成體胃底（圖1I）和賁門數(shù)量較多，回腸和直腸（圖1J）偶見。

開放型嗜銀細(xì)胞呈錐體形、燒瓶狀、蝌蚪狀、短棒狀或長棒狀，主要分布于幼體、亞成體和成體的胃底（圖1K-M），幽門（圖1N）、回腸（圖1O）、回腸和直腸（圖1P）偶見。

2 年齡和消化道部位對嗜銀細(xì)胞分布密度的影響

中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的分布密度既有年齡差異（F2,168= 4.947,P＜0.01），也有部位差異（F7,168= 8.581,P＜0.01），但年齡和部位之間無交互作用（F14,168= 1.128,P＞0.05）。

圖1 中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化。A，幼體食道圓形的嗜銀細(xì)胞；B，幼體胃底圓形的嗜銀細(xì)胞；C，幼體幽門橢圓形的嗜銀細(xì)胞；D，幼體十二指腸橢圓形的嗜銀細(xì)胞；E，亞成體十二指腸橢圓形的嗜銀細(xì)胞；F，亞成體胃底橢圓形的嗜銀細(xì)胞；G，亞成體幽門橢圓形的嗜銀細(xì)胞；H，亞成體回腸橢圓形的嗜銀細(xì)胞；I，成體胃底橢圓形的嗜銀細(xì)胞；J，成體直腸橢圓形的嗜銀細(xì)胞；K，幼體胃底長棒狀的嗜銀細(xì)胞；L，亞成體胃底錐體形的嗜銀細(xì)胞；M，亞成體胃底燒瓶狀的嗜銀細(xì)胞；N，幼體幽門長棒狀的嗜銀細(xì)胞；O，亞成體回腸蝌蚪狀的嗜銀細(xì)胞；P，成體直腸短棒狀的嗜銀細(xì)胞。EP，上皮；SG，胃腺；箭頭示嗜銀細(xì)胞；比例尺，15μmFig.1 Age-related changes in morphological characters of argyrophil cells along the digestive tract of Bufo gargarizans. A, round shaped argyrophil cells in the esophagus of juvenile toads; B, round shaped argyrophil cells in the fundus of juvenile toads; C, ellipse shaped argyrophil cells in the pylorus of juvenile toads; D, ellipse shaped argyrophil cells in the duodenum of juvenile toads; E, ellipse shaped argyrophil cells in the duodenum of sub-adult toads; F, ellipse shaped argyrophil cells in the fundus of sub-adult toads; G, ellipse shaped argyrophil cells in the pylorus of sub-adult toads; H, ellipse shaped argyrophil cells in the ileum of sub-adult toads; I, ellipse shaped argyrophil cells in the fundus of adult toads; J, ellipse shaped argyrophil cells in the rectum of adult toads; K, long bar shaped argyrophil cells in the fundus of juvenile toads; L, pyramid shaped argyrophil cells in the fundus of subadult toads; M, flask shaped argyrophil cells in the fundus of sub-adult toads; N, long bar shaped argyrophil cells in the pylorus of juvenile toads; O,tadpole-like shaped argyrophil cells in the ileum of sub-adult toads; P, short bar shaped argyrophil cells in the rectum of adult toads. EP, epithelium; SG,stomach gland; arrows indicating argyrophil cells; scale bar, 15μm

幼體和亞成體十二指腸的分布密度都高于成體（F2,21= 4.463,P＜0.05），食道和腸道各段均隨年齡增加而趨于減少，幽門趨于增加，賁門先升后降，但均無年齡差異（表1）。

幼體胃底的分布密度顯著高于其他消化道各段（F = 5.320,P＜0.01），但其他各段間均無顯著差異；亞成體胃底和賁門顯著高于幽門、空腸、回腸和直腸（F7,56= 2.189,P＜0.05），食道和十二指腸與其他消化道各段均無顯著差異；成體胃底和賁門顯著高于腸道各段（F7,56= 3.128,P＜0.01），食道和幽門與其他消化道各段均無顯著差異（表1）。

表1 中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞分布密度的年齡和部位變化（單位：細(xì)胞個數(shù)/400×視野）Tab. 1 Age-related and segmental changes in distribution densities of argyrophil cells along the digestive tract of Bufo gargarizans (unit: cells/400× fields)

討 論

幼體、亞成體和成體中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)的增齡變化不明顯，成體十二指腸的密度低于幼體和亞成體，不同年齡組都在賁門和胃底密度較高，這可能與各年齡組的消化生理特性及十二指腸的功能狀態(tài)有關(guān)。

1 嗜銀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞廣泛分布于登陸后的不同年齡段，形態(tài)上可分為閉合型細(xì)胞和開放型細(xì)胞，閉合型細(xì)胞呈圓形或橢圓形，開放型細(xì)胞多呈棒狀、錐體形等形狀，嗜銀細(xì)胞的多種形態(tài)可能與切片所切位置有關(guān)，也可能與物種分類地位或消化生理狀態(tài)有關(guān)[10]。研究表明，北方狹口蛙（Kaloula borealis）消化道嗜銀細(xì)胞形態(tài)多為圓形[13]，而黑龍江林蛙（Rana amurensis）[14]和中國林蛙（Rana chensinensis）[15]多呈錐體形和梭形。中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征未見明顯的增齡變化，可能主要依賴數(shù)量變化來適應(yīng)年齡的增長和可變的消化生理狀態(tài)。

2 消化道同一部位嗜銀細(xì)胞分布密度的增齡變化

成體中華蟾蜍十二指腸嗜銀細(xì)胞的分布密度低于幼體和亞成體，其他消化道各段隨年齡增加而增加或減少,或者呈波浪狀波動,但各部位均無明顯的年齡差異。兩棲動物消化道嗜銀細(xì)胞及其分泌的主要激素的出現(xiàn)時間隨物種而變化，但通常隨發(fā)育進程而增多[11]，這與消化功能的逐漸發(fā)育和完善有關(guān)。例如，處于變態(tài)發(fā)育30～46期的極北鯢（Salamandrella keyserlingii），食道、胃和小腸中的嗜銀細(xì)胞分別見于第43、42和41期[7]。50日齡前，小鼠十二指腸、回腸和盲腸嗜銀細(xì)胞的密度高峰分別見于20、20和5日齡[16]。登陸后，幼體和亞成體中華蟾蜍攝食量相對較大、生長快速，十二指腸嗜銀細(xì)胞分布密度的大幅度提升有助于加快對食物的消化和吸收過程。然而，幼體、亞成體和成體中華蟾蜍空腸和直腸生長抑素細(xì)胞的分布密度卻均隨年齡增加而顯著增加，但十二指腸無明顯的年齡差異[17]，提示嗜銀細(xì)胞所包含的多種內(nèi)分泌細(xì)胞的分布密度可能存在不同的增齡模式。

3 同一年齡組消化道不同部位嗜銀細(xì)胞分布密度比較

中華蟾蜍的身體大小不受短期禁食和重喂食的影響，但消化器官大小隨食物條件而變化[18]?；ū丑蛤苡左w、亞成體和成體消化道嗜銀細(xì)胞的分布密度都在食道最高，密度低谷分別出現(xiàn)于賁門和空腸、直腸、胃底、十二指腸、空腸和直腸[11]。不同年齡組中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞呈波浪形分布，且都在胃部分布密度較高，這可能與感知食物刺激和促進食物下行有關(guān)，此后上升或下降的內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量可能與個體的消化生理狀態(tài)或內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)顆粒的周期性排出有關(guān)。對小鼠腸道的研究表明，內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量的波浪形波動可能與細(xì)胞內(nèi)顆粒的周期性排出有關(guān)，部分內(nèi)分泌細(xì)胞顆粒的全部釋放與消化功能的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此會導(dǎo)致內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量的減少[16]。

總之，登陸后中華蟾蜍消化道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征無明顯改變，主要依賴嗜銀細(xì)胞數(shù)量的增減來滿足不同年齡段消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力。