蠶絲絲膠蛋白及其水解產(chǎn)物的抗氧化性能研究

趙 林 朱義旺 謝艷招 陳文明

(福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)研究所，福建 泉州 362332)

生物體在新陳代謝的過(guò)程中，體內(nèi)不斷產(chǎn)生多種自由基，其中尤以氧自由基最多，它們是需氧生物有氧呼吸的產(chǎn)物[1]。正常情況下，生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基能夠被其體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)有效清除，同時(shí)使受自由基損傷的生物大分子，在監(jiān)視和修復(fù)系統(tǒng)的作用下得以改正，即使還剩下未被很好修復(fù)的細(xì)胞，也可通過(guò)凋亡由吞噬細(xì)胞清除，維持了自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡[2,3]。但在病態(tài)情況下，或者隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)的自由基將會(huì)進(jìn)一步增多，活性氧自由基的產(chǎn)生和清除平衡可能被打破，過(guò)量的活性氧自由基則可能對(duì)生物體內(nèi)的生物大分子如細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、酶和DNA等造成損傷，影響機(jī)體健康，導(dǎo)致諸如癌癥、高血壓和糖尿病等疾病的產(chǎn)生。

已經(jīng)有許多研究證實(shí)，蛋白質(zhì)水解后生成的多種物質(zhì)具有抗氧化功能，對(duì)活性氧自由基有一定的清除作用。絲膠蛋白是天然蠶絲的主要成分之一，其被覆在絲素外部的膠質(zhì)物質(zhì)即絲膠蛋白，占總重量的25%，己在高級(jí)化妝品、醫(yī)用生物材料和表面活性改性材料等方面得到廣泛應(yīng)用。早在1998年，日本山田英幸等就報(bào)道過(guò)絲膠蛋白具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和酪氨酸酶活性的作用[4]。國(guó)內(nèi)周麗霞[5]利用家蠶繭殼經(jīng)過(guò)高溫高壓水脫膠處理后，分離和純化了5種不同蠶繭品種的絲膠蛋白并對(duì)已純化絲膠樣品的體外生物活性如抗氧化、抑制酪氨酸酶活性和抑制a-葡萄糖糖營(yíng)酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分離純化的絲膠蛋白均具有一定清除自由基、抑制黑色素生成的作用。相入麗[6]將蠶絲經(jīng)過(guò)高溫高壓水脫膠處理、高溫高壓堿性水脫膠處理和中性蛋白酶水解后，制成了6種小同分子量范圍的絲膠肽及其水解物，研究表明6種絲膠肽均具有抑制黑色素生成的作用。本文以蠶絲為原料，經(jīng)過(guò)不同條件的高溫高壓水脫膠處理得到不同絲膠蛋白，并通過(guò)其對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子清除能力的測(cè)定，優(yōu)選出最佳處理工藝，并用高溫高壓堿法水解得到絲膠多肽，并研究了其抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

蠶絲(購(gòu)于杭州)，焦性沒食子酸(分析純，汕頭市西隴化工廠)；三羥甲基氨基甲烷Tris(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(分析純，汕頭市西隴化工廠)。

1.1.2 儀器

YXQ-LS-立式壓力滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司醫(yī)療設(shè)備廠)、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電子精密天平PL203(梅特勒-托利多儀器有限公司)、漩渦振蕩器H-101(上?？岛坦怆妰x器有限公司)、UV-2100紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)、榮華HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)漩渦振蕩器H-101(上?？岛坦怆妰x器有限公司)、pH211哈納pH計(jì)(北京哈納科技有限公司)、電子萬(wàn)用爐(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高溫高壓脫膠法制備蠶絲絲膠液

將蠶絲洗凈，除去雜質(zhì)和塵埃，稱取3克蠶絲置于干凈錐形瓶中，以浴比1：25置于立式壓力蒸汽滅菌器中。錐形瓶瓶口用棉花塞緊，設(shè)定一定時(shí)間及溫度，反應(yīng)后將脫膠液轉(zhuǎn)入碘量瓶中，待冷卻后放入冰箱4℃保存?zhèn)溆?。脫膠時(shí)間及溫度設(shè)計(jì)如表1所示：

表1 蠶絲脫膠處理?xiàng)l件水平表

A1是實(shí)驗(yàn)的吸光度值；

A2是脫膠液不加鄰苯三酚的吸光度值；

A3是鄰苯三酚不加脫膠液的吸光度值。

1.2.3 不同絲膠蛋白加樣量對(duì)其抗氧化性能的影響實(shí)驗(yàn)

如表2所示，取7只25 mL的錐形瓶，各加入4 mL pH 為8.2的Tris-HCl(0.05 mol/L)緩沖液，再分別加入不同量脫膠液以及1 mL 25 mmoL/L的鄰苯三酚，混勻后25 ℃ 保溫，在5 min時(shí)加入8 % HCl終止反應(yīng)。再取原液稀釋5倍，過(guò)濾后在320 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算超氧自由基抑制率。

1.2.4 不同保存時(shí)間、溫度對(duì)絲膠蛋白的抗氧化性能影響

選取一組抗氧化能力最強(qiáng)的脫膠液樣品，分別于37℃、50℃、60℃ 中保藏，間隔一段時(shí)間后取樣。然后測(cè)定其超氧自由基抑制率。研究不同保存時(shí)間和溫度對(duì)絲膠蛋白的抗氧化性能的影響。

表2 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定加樣表

1.2.5 高溫高壓堿法水解制備蠶絲多肽

選取抗氧化性能最優(yōu)的脫膠液樣品，取70 mL裝入錐形瓶中，用NaOH調(diào)節(jié)脫膠液pH值，然后用棉花塞緊瓶口，放入滅菌器中，高壓滅菌器的溫度及反應(yīng)時(shí)間分別按表3設(shè)定。反應(yīng)結(jié)束取出，冷卻后調(diào)節(jié)pH = 7，放入透析袋中進(jìn)行透析，換水6次，每次30min，得到水解產(chǎn)物。4 ℃ 冰箱中保存。并測(cè)定水解產(chǎn)物的氧自由基抑制率。

表3 絲膠水解處理?xiàng)l件設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 蠶絲脫膠最適處理?xiàng)l件的選擇

表4說(shuō)明在不同處理時(shí)間和處理溫度下所得到的脫膠液具有不同的氧自由基清除能力。在 100 ℃條件下可以得到較高的自由基清除率，且保持該溫度條件，增加脫膠時(shí)間，樣品的氧自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，在 60 min 時(shí)達(dá)到峰值，清除率高達(dá) 60.24% 。因此，最佳脫膠條件為反應(yīng)溫度為 100 ℃，脫膠時(shí)間 60 min 。

表4 脫膠時(shí)間、溫度對(duì)氧自由基清除率的影響

2.2 絲膠蛋白不同加樣量對(duì)其抗氧化能力影響

由表5可知，當(dāng)加樣量在0.5 ～ 3 mL范圍內(nèi)，樣品對(duì)氧自由基的清除率在45% ～ 67% 范圍內(nèi)波動(dòng)，當(dāng)加樣量為3 mL時(shí)，氧自由基清除率可以達(dá)到66.67% 。

表5 加樣量對(duì)氧自由基清除率的影響

2.3 保存時(shí)間對(duì)絲膠蛋白的抗氧化性能影響

在37℃條件下，當(dāng)保存時(shí)間在 0 ～ 10 h內(nèi)，樣品氧自由基清除率隨著保存時(shí)間的增加而增加，當(dāng)保存時(shí)間達(dá)到10 h時(shí)，絲膠蛋白對(duì)氧自由基清除率最大。繼續(xù)增加保存時(shí)間，樣品的氧自由基清除率反而下降。在 50 ℃、60 ℃ 的條件下，樣品氧自由基清除率在 50% 左右上下波動(dòng)，保存時(shí)間對(duì)樣品氧自由基清除能力幾乎沒有影響。這很可能因?yàn)?37 ℃ 是菌生長(zhǎng)的最適溫度，因此抗氧化活性隨著菌量的增加而降低。而在 50 ℃、60 ℃ 條件下，菌不適生長(zhǎng)，所以樣品能夠保持較好的抗氧化活性。

2.4 水解條件對(duì)氧自由基清除率的影響

絲膠蛋白雖然有較好的抗氧化能力，但分子量大，如果用于護(hù)膚品中，透皮效果差，吸收率低。有研究表明絲膠蛋白水解物去除超氧自由基的能力較強(qiáng)[8]，且水解物分力量小，容易透過(guò)皮膚被人體吸收。絲膠蛋白分子含有兩條通過(guò)二硫鍵連接的肽鏈，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主，并含有部分β構(gòu)象，幾乎不含α螺旋結(jié)構(gòu)，在一定溫度、反應(yīng)時(shí)間和 pH 值條件下，可使分子中肽鍵斷裂，形成多肽分子。不同水解條件可使絲膠蛋白具有不同的水解程度，所產(chǎn)生的多肽抗氧化能力也不同。如表5所示，不同的水解條件下，絲膠多肽對(duì)氧自由基的清除能力相差較大，最大差值可達(dá) 19% 。在 120 ℃ 、4 h 且pH = 11 時(shí)，絲膠多肽的氧自由基清除率最大，可達(dá) 29.07% 。因此，絲膠蛋白的最佳水解條件為：水解溫度120℃，水解時(shí)間 4 h、水解液 pH = 11 。

表6 不同水解液樣品對(duì)超氧自由基的清除率

3 結(jié)論

在不同溫度和壓力下對(duì)蠶絲進(jìn)行脫膠處理，得到多組脫膠液，并用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定各組脫膠液的抗氧化能力。選取抗氧化性能最強(qiáng)的一組脫膠液用高溫高壓堿法進(jìn)行水解，得到絲膠多肽水解液，同樣考察了水解液的抗氧化性能。結(jié)果顯示高溫高壓脫膠的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度 100 ℃，脫膠時(shí)間60 min。最佳水解條件為：溫度120 ℃，pH = 11，時(shí)間4 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示在0.5 ～ 3.0 mL范圍內(nèi)，脫膠樣品的氧自由基清除率隨著加樣量的增大而增大，當(dāng)加樣量為3 mL時(shí)，其氧自由基清除率可達(dá) 66.67% 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示樣品在37 ℃條件下保存，脫膠液的抗氧化活性將隨放置時(shí)間的增加而明顯降低，而在50 ℃、60 ℃條件下保存，其抗氧化活性不隨放置時(shí)間的增加發(fā)生明顯變化。

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