益氣養(yǎng)陰活血法對膿毒血癥模型大鼠血清TNF-α、IL-6 與IL-10 的影響①

梁 群 刁冰冰 王 叢 (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

膿毒癥(Sepsis)是機(jī)體在受感染后或在休克、創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)下自身免疫系統(tǒng)被過度激活致使大量炎性介質(zhì)失控性釋放，繼而引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)［1］，因其常并發(fā)膿毒癥休克及多器官功能衰竭，成為各地醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因之一。目前對預(yù)測膿毒癥的發(fā)展方向和預(yù)后評估上臨床仍缺乏有效的手段，因此積極探索膿毒癥炎癥介質(zhì)和抗炎介質(zhì)濃度的變化，將為濃毒癥患者的疾病發(fā)展方向和預(yù)后評估提供新策略。在參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的炎癥介質(zhì)中，最為典型的炎癥介質(zhì)為白細(xì)胞介素(IL-6)，而且是導(dǎo)致膿毒癥患者組織損傷的重要因素。目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的炎癥抑制細(xì)胞因子則是白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，它主要由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生，因其具有良好的抗炎和免疫抑制特性而成為目前膿毒癥相關(guān)研究的主要炎癥因子［2］。本研究主要是觀察化纖膠囊(益氣養(yǎng)陰活血)對膿毒血癥模型大鼠血清TNF-α、IL6 與IL10 的影響從而對臨床上膿毒血癥患者的治療和相關(guān)炎癥介質(zhì)的變化給予提供幫助。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性和雌性Wistar 大鼠各45 只，體質(zhì)量為(150±20)g，提供單位為黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，自然光線采光，溫度(21±4)℃，相對濕度54%～76%，采用普通專用配比的飼料預(yù)養(yǎng)5 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.1 藥物化纖膠囊(10g/粒) 由黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院制劑室制備，成分包含黨參、黃芪、丹參、當(dāng)歸、太子參、沙參、麥門冬、蛤蚧等16 味中藥。血必凈注射液:每支10 ml，天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:國藥準(zhǔn)字Z20110233。

1.1.2 血液標(biāo)本采集 運(yùn)用常規(guī)方法，存于抗凝試管中，充分搖勻，3 000 r/min，常溫離心15 min，后存放于-80℃冰箱內(nèi)保存標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)前將標(biāo)本復(fù)蘇于常溫下，采用同一批號試劑進(jìn)行測定，血清TNF-α、IL-10 和IL-6 濃度用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定(TNF-α、IL-10 和IL-6 試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，美國A＆D 公司生產(chǎn))，實(shí)驗(yàn)步驟按標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

1.2 造模及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用動物模型制備 采取禁食24 h 后以10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)進(jìn)行腹腔注射麻醉。將大鼠四肢及牙齒捆綁以固定動物模型，取仰臥位于操作臺，用5%碘伏溶液以消毒動物模型，用75%酒精溶液給動物模型以脫碘。沿腹正中線切開腹部皮膚約2 cm，用1 號線采取盲腸結(jié)扎術(shù)(距盲端1～2 cm 處)結(jié)扎，在結(jié)扎處遠(yuǎn)端采用18 號穿刺針穿刺盲腸2 至3 次，最后將盲腸納入腹腔后封閉腹腔，術(shù)后2 d 大鼠膿毒血癥模型造模完成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將90 只大鼠隨機(jī)分成空白組(n=9)、膿毒癥組(模型組，n=9)、血必凈組(對照組，n=36)及化纖膠囊組(治療組，n=36)，血必凈組(對照組)和化纖膠囊組(治療組)又分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ6 個亞組，每組6 只。Ⅰ組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^測CLP 術(shù)后7 d 的存活率，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5 個亞組分別為CLP 術(shù)后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h組。空白組不造模，其余3 組均造模。造模2 d 后治療組給予化纖膠囊，1 次/d 口服;血必凈組(對照組)予血必凈1 次/d 靜脈注射;空白組與膿毒癥組(模型組)均灌等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d 直至檢查前24 h 停藥。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集及檢測 在各規(guī)定的時間點(diǎn)上，直接在大鼠心臟處取4 ml 血并在血里加入乙二胺四乙酸，在4℃下的環(huán)境中用抗凝管以3 000 r/min 離心15 min 后，在-80℃冰箱內(nèi)保存上清液。采用ELISA-α 法檢測血清中TNF-α、IL-10 和IL-6的水平，操作流程按照試劑盒所附說明書步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s 表示，采用方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠7 d 生存率的比較 膿毒血癥組與化纖膠囊組的7 d 生存率分別為0 和83.33%。化纖膠囊組生存率明顯高于膿毒血癥組存活率，兩組比較差異明顯(P＜0.05)，證明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难獫{TNF-α 水平比較 如表1 所示，膿毒癥組大鼠血清TNF-α 濃度快速升高，膿毒癥組大鼠6 h、12 h、24 h 血清TNF-α 濃度變化較空白組比較顯著升高，各時間點(diǎn)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過治療化纖膠囊組大鼠12 h、24 h 血清TNF-α 濃度較膿毒癥組顯著降低，差異比較顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，對照組和治療組在治療效果上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 膿毒血癥組模型的血清IL-6 濃度動態(tài)變化 與空白組的濃度變化相比，膿毒血癥組大鼠血清IL-6 濃度在發(fā)病6 h、12 h 及24 h 快速升高，各時間點(diǎn)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，化纖膠囊組大鼠12 h、24 h 血清IL-6 濃度與膿毒血癥組同時期濃度比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，對照組和治療組在治療效果上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 各組大鼠血漿IL-10 水平濃度動態(tài)變化 如表3 所示，膿毒血癥組與空白組比較，血漿IL-10 水平下降(P＜0.05);與膿毒血癥組比較，血必凈組IL-10 水平在CLP 后6 h 下降明顯，12 h 到達(dá)峰值，各時間點(diǎn)(除2 h 時點(diǎn)外)與膿毒血癥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與膿毒血癥組比較，化纖膠囊組在6 h、12 h、24 h 及48 h 4 個時間點(diǎn)血漿水平IL-10 下降(P＜0.01)。

表1 各組血清TNF-α 濃度變化比較(±s，ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s，ng/ml)

表1 各組血清TNF-α 濃度變化比較(±s，ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s，ng/ml)

Note:Model group compared with blank group，1)P＜0.05;the treatment group compared with model group，2)P＜0.05.

表2 各組血清IL-6 濃度變化比較(±s，pg/ml)Tab.2 Comparison of serum IL-6 concentrations in each group(±s，pg/ml)

Note:Model group compared with blank group，1)P＜0.05;the treatment group compared with model group，2)P＜0.05.

表3 各組模型血清IL-10 水平變化比較(±s，ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s，ng/L)

表3 各組模型血清IL-10 水平變化比較(±s，ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s，ng/L)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.01;the treatment group compared with model group，2)P＜0.01.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用盲腸穿刺結(jié)扎法(CLP)制備Wistar大鼠膿毒癥模型是因CLP 模型更接近臨床急性腸穿孔和腹膜炎的病發(fā)過程，能較真實(shí)地反映膿毒癥的病理生理變化使研究更具說服力，在膿毒癥過程的早期身體釋放炎癥因子，典型的如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6 等，機(jī)體以激活白細(xì)胞及凝血系統(tǒng)來阻止病原微生物的進(jìn)一步擴(kuò)散，表現(xiàn)以促炎癥反應(yīng)為主。IL-10 等抗炎因子和可溶性TNF 受體，往往伴隨促炎因子的生成而過度產(chǎn)生，并且有對抗炎癥介質(zhì)的作用，防止過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。炎癥介質(zhì)和抗炎介質(zhì)是決定在膿毒血癥過程中能否達(dá)到動態(tài)平衡的主要因素［3］。如果促炎反應(yīng)占優(yōu)勢時，表現(xiàn)為免疫亢進(jìn)或全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，使機(jī)體對外來打擊反應(yīng)過于強(qiáng)烈，致使出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(Multipleorgan dysfunction syndrome，MODS);當(dāng)抗炎反應(yīng)占優(yōu)勢時，則體現(xiàn)為代償性抗炎癥反應(yīng)綜合征或免疫麻痹，使機(jī)體對外來打擊反應(yīng)下降，對感染更為易感并且加重膿毒癥和MODS［3，4］。膿毒癥更易引發(fā)SIRS［5］若SIRS 進(jìn)一步發(fā)展將誘發(fā)腦部疾病、腎功能不全，心肺功能受損等其他相關(guān)疾病，甚至部分或大部分功用喪失［6-8］，于是在炎癥反應(yīng)的初期控制其發(fā)展和惡化，防止SIRS 的發(fā)生，將有利于縮短病程而且對減緩病情又有非常重要的臨床價值。目前醫(yī)學(xué)界研究顯示對炎性介質(zhì)的治療將為重癥膿毒血癥的治療提供新的對策，臨床資料顯示膿毒血癥患者存活率多少與炎性介質(zhì)密切相關(guān)，經(jīng)藥物治療的膿毒癥血癥患者血漿TNF-α、IL-6 水平下降則患者的存活率較高，反之，血漿TNF-α、IL-6 水平上升則患者的存活率較低。本研究表明，化纖膠囊(益氣養(yǎng)陰活血)能顯著降低膿毒血癥大鼠血漿TNF-α、IL-6 的水平，對膿毒血癥大鼠血漿IL-10 的水平下降不明顯，尚需進(jìn)一步結(jié)合大樣本實(shí)驗(yàn)研究觀察。

據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示膿毒癥病因復(fù)雜，治療困難，病死率高是目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)難以治愈的危重癥疾病之一，因此做到早發(fā)現(xiàn)、早治療膿毒癥是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。要從根本上提高膿毒癥患者生存率，則要從其發(fā)病機(jī)制的研究上尋找新的更有效的干預(yù)靶點(diǎn)［9，10］。中醫(yī)藥雖然對膿毒癥的治療有一定療效和創(chuàng)新，卻未能從分子生物學(xué)方面闡釋其作用機(jī)制，因此應(yīng)用中藥治療膿毒癥并不能在國際上得到推廣。本實(shí)驗(yàn)擬用“益氣養(yǎng)陰活血法”從益氣養(yǎng)陰和活血化瘀兩方面同時入手，系統(tǒng)研究益氣養(yǎng)陰活血方化纖膠囊對同時糾正免疫、炎癥方面在分子水平上的作用機(jī)制，運(yùn)用中藥復(fù)方制劑早期多靶向治療，闡明該中藥防治膿毒血癥的作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化纖膠囊能降低膿毒癥大鼠病死率，值得在臨床工作中進(jìn)一步推廣研究。

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