刺五加細胞色素P450基因的克隆與表達分析

刺五加細胞色素P450基因的克隆與表達分析

邢朝斌 吳鵬 李非非 劉巖 周秘 修樂山
（河北聯(lián)合大學生命科學學院，唐山 063000）

根據(jù)已報道的人參、三七等植物的細胞色素P450（Cytochrome P450，P450）基因的cDNA序列設計引物，利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全長序列，并分析其在不同生長發(fā)育時期和器官中的表達情況。結果顯示，克隆了全長為1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列，該基因編碼469個氨基酸殘基組成的蛋白質。GenBank登錄號為KF498590，與人參、三七的P450氨基酸序列一致性分別為91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生長發(fā)育時期和器官中均有表達，但表達量具有顯著差異（P＜0.05）。最大表達量出現(xiàn)在盛花期，為最低表達量（萌芽期）的1.26倍。各器官中，葉片的表達量最高，是最低量幼莖的1.49倍。

刺五加 細胞色素P450 克隆 表達分析

刺五加Eleutherococcus senticosus（Rupr.et Maxim）Maxim是我國傳統(tǒng)的珍貴藥用植物，具有抗腫瘤、抗輻射、提高機體免疫力等多種藥理作用和生理活性，皂苷類化合物為其主要活性成分之一［1］。與其他藥用植物相似，刺五加中的皂苷含量普遍較低。探明三萜類化合物的生物合成途徑是利用代謝工程直接合成或通過基因工程工業(yè)化生產(chǎn)三萜類化合物的關鍵基礎［2］。三萜類化合物的生物合成一般分為，前體的合成、形成三萜皂苷骨架和后修飾過程3個階段［3］。目前對三萜類合成的分子機理的研究主要集中在前體合成和形成三萜皂苷骨架階段，而對決定三萜皂苷種類起主要作用的三萜碳環(huán)的復雜修飾過程研究較少［4］。細胞色素P450（cytochrome P450，P450）是三萜皂苷生物合成后修飾過程中的一個關鍵酶，該酶含有血紅素配基，是植物中最大的一個超基因家族，其不同家族成員參與了多種植

物的次生代謝途徑［5］。目前僅見少數(shù)幾個參與三萜皂苷生物合成的P450基因的報道［4］。因此克隆刺五加P450基因的全長序列，并分析其在不同生長發(fā)育時期、不同器官中的表達規(guī)律，對深入研究P450基因在刺五加皂苷生物合成中的作用機制和表達調控具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試刺五加采自黑龍江省雞西市，經(jīng)河北聯(lián)合大學生命科學學院邢朝斌副教授鑒定。分別以4-9月的葉和8月的根、莖、葉片和葉柄（編號為1-10）為提取總RNA的試材。

1.1.2 試劑 RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit購自Thermo公司。質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Biomiga公司。TOP10感受態(tài)細胞、PGM-T克隆試劑盒和植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。TaqDNA聚合酶和LATaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司。X-Gal、IPTG、dNTPs、異硫氰酸胍購自北京拜爾迪生物技術有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 刺五加總RNA的提取與P450基因的獲得 根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的說明，分別提取1-10號刺五加樣本的總RNA，并參照RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit的說明，以2 μL的總RNA為模板，將上述樣本分別逆轉錄為cDNA。利用根據(jù)GenBank登錄的與刺五加同科的人參（JX036031）、三七（GU997670）的P450基因序列設計的上游引物P4501S1：5'- ATGGATCTCTTTATCTCATC -3'和下游引物P4501X1：5'- ATGGATCTCTTTATCTCATC -3'，以逆轉錄獲得的刺五加葉片cDNA為模板，PCR擴增刺五加P450基因的cDNA序列。反應體系50 μL，其中上下游引物各1 μL，10×LATaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，模板cDNA 2 μL，LATaqDNA聚合酶0.6 μL，補ddH2O至50 μL。反應條件為：預變性95℃、3 min；變性94℃、30 s；退火50℃、30 s；延伸72℃、1 min 40 s。35個循環(huán)后72℃補充延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、回收、克隆入PGM-T質粒載體，轉化大腸桿菌TOP10后，送Invitrogen公司測序。

1.2.2 刺五加P450基因的生物信息學分析 參照邢朝斌等［6］的方法，利用MotifScan、ProtParam、ProtScale、SOPMA和TMHMM 2.0等在線軟件進行生物信息學分析。使用MEGA 5.21軟件中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 刺五加P450基因的表達分析 以逆轉錄獲得的1-10號的刺五加cDNA為模板，參照文獻［6］的方法，利用預計擴增P450基因長度為139 bp的上游引物P450RTS：5'- TGGGTATCCAAAGAAGCAGG-3'，下游引物P450RTX：5'-CAGCCAAGCCGAGTAGAGC -3'，和預計擴增刺五加GAPDH基因長度為134 bp的引物RGS和RGX［6］，進行表達量分析。

2 結果

2.1 刺五加P450基因的克隆與鑒定

利用引物P4501S1和P4501X1，RT-PCR擴增刺五加的cDNA，測序獲得長1 410 bp的片段（圖1），與預期長度相符。將擴增片段重組入PGM-T Vector后，PCR擴增產(chǎn)物的大小與刺五加總RNA的RTPCR產(chǎn)物大小相等。

圖1 刺五加P450基因的克隆

2.2 刺五加P450基因的生物信息學分析

測序結果表明，所獲得的刺五加P450基因cDNA的長度為1 410 bp，上游為起始密碼子ATG，下游為終止密碼子TAA，推測其編碼469個氨基酸殘基組成的蛋白質，GenBank登錄號為KF498590。預測的蛋白質分子質量為53.083 kD，理論等電點（pI）為8.62。

通過NCBI的BLAST比對發(fā)現(xiàn)，刺五加P450蛋白與已知的蛋白質結構功能數(shù)據(jù)庫中其他物種的

P450具有相似的結構功能域。刺五加P450的409-418位的氨基酸［FGGGPRMCPG］為P450家族的典型保守結構域，27-466位的氨基酸為P450的標志性序列。通過TMHMM軟件分析得知，刺五加P450蛋白的5-21和276-292位氨基酸處存在跨膜螺旋，定位于線粒體。運用SOPMA軟件預測刺五加P450蛋白的二級結構的結果表明，該蛋白含有222個α螺旋，占47.33%；61個延伸鏈，占13.01%；18個β折疊，占3.84%；168個無規(guī)則蜷曲，占35.82%。

2.3 P450的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA軟件，將GenBank中登載的12個物種的P450蛋白與刺五加的P450蛋白進行聚類分析，構建P450蛋白的系統(tǒng)進化樹（圖2）。刺五加與同為五加科的人參、三七和西洋參的親緣關系最近，首先聚為一支，可信度達100%，之后與其他雙子葉植物聚為一個大的分支，單子葉植物和裸子植物單獨聚為一個分支，之后與人類聚在一起。

圖2 P450氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 刺五加P450基因的表達分析

刺五加P450基因在不同生長發(fā)育時期和器官中的表達量變化如圖3所示。自萌芽后的整個生長期中，P450基因均有表達，但表達量差異顯著（P＜0.05）。在整個生長期中，P450的表達呈現(xiàn)先低后高的變化趨勢。萌芽期（4月26日）的表達量最低，之后顯著升高，進入盛花期（6月26日）至葉片衰老期（9月26日）后，P450的表達量始終維持在較高水平。其中盛花期（6月26日）的表達量最高，是最低表達量萌芽期的1.26倍，但盛花期、果實快速生長期（7月26日）、果實基本成熟期（8月26日）和葉片衰老期的表達量間差異未達顯著水平。

刺五加的P450基因在葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達，但表達量具有顯著差異（P＜0.05）（圖3）。葉片中的表達量最高，葉柄次之，分別為最低表達量（幼莖）的1.49和1.24倍，幼莖和根中的表達量間差異不顯著。

圖3 刺五加不同生長發(fā)育時期及器官中P450基因的表達變化

3 討論

細胞色素P450基因是一個古老的超基因家族，其編碼蛋白為植物中最大的酶蛋白家族，在植物體內(nèi)擔當著重要的功能［7］。在所有已知結構的P450中都存在一個保守的血紅素結合域，含有保守的FxxGxRxCxG序列，該序列是鑒定P450的主要特征，其中的半胱氨酸（C）是亞鐵血紅素的第5個軸配體，在所有的P450 中完全保守［7，8］。本試驗所克隆出的刺五加P450基因的編碼蛋白409-418位的氨基酸為［FGGGPRMCPG］，與上述特征完全相符。氨基酸序列比對的結果顯示，刺五加P450的氨基酸序列與人參（Panax ginseng）、三七（P. notoginseng）、西洋參（P. quinquefolius）和丹參（Salvia miltiorrhiza）的一致性分別達到91.5%、90.4%、89.3%和70.6%，依據(jù)“2個P450的氨基酸序列一致性如果大于

55%，則它們屬于同一個亞家族”的原則［7］，初步判定刺五加的P450屬于P450家族中調控三萜皂苷類化合物形成的CPY85亞家族［9-11］。同時，依據(jù)P450的氨基酸序列進行的系統(tǒng)進化分析結果也與傳統(tǒng)的分類結果相一致。

刺五加P450基因在不同生長發(fā)育時期和器官中表達量的分析結果表明，刺五加的P450基因在不同生長發(fā)育時期和葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達，其表達量隨著生長發(fā)育的進行逐漸上升，其中，盛花期的葉中的表達量最高。這與甘草［12］和蒺藜苜蓿［13］P450基因的表達特點相似。所不同的是甘草和蒺藜苜蓿的P450恒定高表達于根器官中，而刺五加中則為葉片中表達量最高，這與甘草［12］和蒺藜苜蓿［13］中皂苷類化合物主要存在于根，刺五加則主要存在于葉片中［1］的特點相符，這預示著P450在刺五加三萜皂苷類化合物的次生代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。

4 結論

刺五加P450基因編碼的蛋白與五加科其他植物P450的氨基酸序列一致性最高，并具有P450基因家族的典型特征序列。

刺五加的P450基因在不同生長發(fā)育時期和器官中均有表達，但表達量具有顯著差異。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450 Gene in Eleutherococcus senticosus

Xing Zhaobin Wu Peng Li Feifei Liu Yan Zhou Mi Xiu Leshan
（College of Life Science，Hebei United University，Tangshan 063000）

In order to clone cytochrome P450（P450）in Eleutherococcus senticosus, the primers were designed according to cDNA of the reported Panax ginseng and P. notoginseng. The full length cDNA of the E. senticosus P450 was cloned by RT-PCR, and analyzed the expression of P450 in different growth periods and organs of E. senticosus. The results showed that the full length of P450 was 1 410 bp, encoded a protein with 469 amino-acid residues, GenBank accession number KF498590. To compare the amino acid sequence of E.senticosus P450 with P. ginseng and P. notoginseng, the amino acid homology was 91.5% and 90.4%. P450 expressed in different growth periods and organs of E. senticosus, and the expression amount differed significantly（P＜0.05）. The highest content of the expression showed up when full opening flower stage, which was 1.26 times as much as that in the lowest at germination stage. The highest content of the expression was in the leaves which was 1.49 times as much as that of the lowest in young stem.

Eleutherococcus senticosus Cytochrome P450 Cloning Expression analysis

2013-09-18

國家自然科學基金項目（30701086），河北省自然科學基金項目（C2009001252），河北省自然科學基金-石藥集團醫(yī)藥聯(lián)合研究基金項目（H2012401006），河北聯(lián)合大學培育基金項目（GP201306）

邢朝斌，男，副教授，研究方向：分子生藥學、藥用植物細胞工程；E-mail：xzbheuu@126.com