灰樹花水提物的提取及其抑菌功能

柴瑞娟，孫 晨

（安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖241000）

灰樹花水提物的提取及其抑菌功能

柴瑞娟，孫 晨

（安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖241000）

為研究水溶液提取灰樹花營養(yǎng)成分，采用水溶液對灰樹花多糖進行了單因素及正交實驗提取，用苯酚-硫酸法對多糖進行了測定。并用濾紙片法研究了灰樹花水提物的抑菌能力。正交實驗結果表明，影響灰樹花多糖提取率的因素大小順序依次是：溫度、液料比、提取時間。灰樹花多糖的提取最優(yōu)條件為：溫度80℃、液料比60∶1（mL∶g）、提取時間2.0h。灰樹花水提物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑分別為8.74、10.23、12.42mm。

灰樹花，水提物，正交實驗，多糖，抑菌性能

真菌多糖生物活性復雜而廣泛，其中，免疫調(diào)節(jié)活性是研究最主要的活性，臨床上真菌多糖可以作為免疫調(diào)節(jié)劑用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的治療，如香菇多糖可劑量依賴性地提高IL-2和TNF-α的基因表達水平和活性，這表明香菇多糖可誘導某些免疫反應[1]?；覙浠ǎ℅rifola frondosa）屬擔子菌亞門、多孔菌科，其主要活性成分是灰樹花多糖，因其有β-（1→6）[2-3]分支，可以抑制腫瘤生長防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、防止正常細胞癌變。

目前研究較多的是灰樹花多糖的提取，傳統(tǒng)的熱水輔以微波[4]、超聲波[5]等手段可以提高灰樹花多糖的提取率，這些方法適合工廠化或?qū)嶒炇?，現(xiàn)實生活中，卻難以走進普通人家。本文以水提法為基礎，探討提取溫度、液料比和時間對灰樹花水提物浸提率的影響，為日常飲食中灰樹花多糖的攝取提供參考，因此以水溶性多糖為指標表征提取率。灰樹花提取物可以清除自由基[6]，但其抑菌功能還少見報道，本文研究了灰樹花水提物的抑菌性能，為灰樹花水溶性成分的生理活性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花（Grifola frondosa） 購于福建省古田縣大豐工貿(mào)有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球（Staphylococcus aureus） 本實驗室保藏；葡萄糖、95%乙醇、苯酚、濃硫酸 國藥集團化學試劑有限公司；青霉素 華北制藥股份有限公司。

CN0250型電子天平 上海民橋精密科技儀器有限公司；YM30型全自動電熱壓力蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療儀器有限公司；250B型數(shù)顯生化培養(yǎng)箱、TGL-16C型高速臺式電動離心機、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 參考文獻[7]準確稱取干燥至恒重的葡萄糖50mg，蒸餾水定容至100mL，再準確吸取5mL該溶液，蒸餾水定容至100mL，得25μg/mL的葡萄糖溶液。稱取苯酚6g，溶于蒸餾水并定容至100mL，即得6%苯酚溶液，棕色瓶中避光保存。分別取25μg/mL的葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于空白干凈試管，每管分別加入6%苯酚溶液1.0mL和濃硫酸各5.0mL，用蒸餾水補足到8.0mL后搖勻放置20min。以不加葡萄糖標準溶液的0號作為空白調(diào)零，在最大吸收波長處（490mm）測定吸光度。

1.2.2 單因素實驗 取6.0g灰樹花烘干（60℃），粉碎機粉碎，對溫度，液料比和提取時間進行多糖提取單因素實驗。3000r/min離心15min后，得到灰樹花多糖提取液，稀釋100倍，用移液管取1mL到試管中，依次向試管中加入1.0mL蒸餾水、1.0mL 6%苯酚溶液、5.0mL濃硫酸，利用苯酚硫酸法[8]測得反應后的溶液OD值，根據(jù)葡萄糖標準曲線讀出OD值對應的多糖濃度，重復3次。

1.2.2.1 溫度對灰樹花多糖提取率的影響 液料比40∶1（mL/g），溫度分別為50、60、70、80、90℃，恒溫水浴浸提2.0h研究溫度對灰樹花多糖提取的影響。

1.2.2.2 液料比對灰樹花多糖提取率的影響 液料比10∶1、25∶1、40∶1、60∶1、80∶1，60℃的恒溫水浴浸提2.0h，研究液料比對灰樹花多糖提取率的影響。

1.2.2.3 提取時間對灰樹花多糖提取率的影響 液料比40∶1，60℃恒溫水浴浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，研究提取時間對灰樹花多糖提取率的影響。

1.2.3 灰樹花多糖的提取正交實驗 因此根據(jù)單因素實驗結果，設計三因素的正交實驗，研究灰樹花多糖的提取，重復3次。

表1 灰樹花多糖水提正交實驗因素水平表Table 1 Design of the orthogonal test of extracting polysaccharide from Grifola frondosa

1.2.4 灰樹花水提物的最小抑菌濃度（MIC） 最小抑菌濃度是指抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長的最低藥物濃度，可用于定量測定體外抗菌活性。按正交實驗的驗證實驗結果提取灰樹花水提物，此水提物為原液，用兩倍法稀釋成1∶2、1∶4、1∶8濃度梯度。采用濾紙片法[9]（直徑6mm）考察原液及不同稀釋度的灰樹花水提物對各供試菌的抑菌效果。并用氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新潔爾滅（1∶2）、青霉素（1.6× 105IU）作相應對比，重復3次。

1.3 灰樹花多糖提取率

灰樹花多糖提取率的計算式為：

多糖提取率（%）=（多糖濃度（μg/mL）×提取液總體積（mL））/（灰樹花質(zhì)量（g）×106）×100。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線測定

得回歸方程：y=0.0264x+0.004，r2=0.9990，表明葡萄糖濃度在0～15μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關系，可以在此范圍內(nèi)采用上述方法測定葡萄糖含量。（y為吸光度，x為葡萄糖含量μg/mL）。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溫度對灰樹花多糖提取率的影響 當溫度小于80℃時，灰樹花多糖的提取率隨著溫度的升高而增加，80℃時多糖的提取率最高，而當溫度大于80℃時灰樹花多糖的提取率有所下降。其原因是：在溫度較低時，升高溫度可以提高傳質(zhì)效率，有利于多糖的浸提，而當溫度高于80℃時，過高的溫度會破壞多糖成分，導致提取率有所下降，與陳欣等[10]報道類似。高溫（90℃）容易破壞多糖。

圖1 溫度對灰樹花多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.2 液料比對灰樹花多糖提取率的影響 液料比會影響溶質(zhì)與提取液的接觸面積，料液比越大，接觸面積越大，多糖就越容易溶出，因此可以看到液料比越大提取率越高。同時液料比在25∶1和40∶1之間時灰樹花多糖的提取率隨著液料比的增大而增加較快，但因為材料中多糖含量是一定的，當液料比大于40∶1時，基本完全溶出，因此多糖的提取率隨著液料比的增大而增加緩慢。

圖2 液料比對灰樹花多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solvent ratio on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.3 時間對灰樹花多糖提取率的影響 不同提取時間條件下灰樹花多糖的提取率有所不同，并且在實驗提取時間條件范圍內(nèi)（1.5～3.0h），灰樹花多糖的提取率隨著提取時間的增加而逐漸增加，而當提取時間大于2h時，隨著提取時間的增加，灰樹花多糖的提取率增加緩慢，因為經(jīng)過2.0h的提取多糖已基本完全溶出。

2.3 灰樹花多糖的提取正交實驗

圖3 時間對灰樹花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

表2 灰樹花多糖的提取三因素正交實驗結果Table 2 Result of orthogonal experiment

極差分析表明溫度在實驗范圍內(nèi)對灰樹花多糖的提取影響相對較大，液料比在實驗范圍內(nèi)對灰樹花多糖的提取影響其次，而提取時間在實驗范圍內(nèi)對灰樹花多糖的提取影響相對最小。因此，由灰樹花多糖的提取三因素正交實驗可以確定灰樹花多糖的提取最優(yōu)條件A3B3C3為：溫度80℃、料液比60∶1、提取時間2.0h。

2.4 正交實驗驗證結果

在最優(yōu)條件下進行灰樹花多糖的提取驗證實驗（重復3次），灰樹花多糖的平均提取率達到7.94%，大于極值，因此正交結果得以驗證。

2.5 灰樹花水提物的抑菌性能

灰樹花水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較明顯，在1∶8時即可對金黃色葡萄球菌的生長產(chǎn)生抑制作用，抑菌圈直徑達到12.42mm；而對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌作用只有在1∶1時才會顯現(xiàn)出來，抑菌圈直徑分別為8.74、10.23mm，通過對三種細菌抑菌圈大小的比較可知灰樹花水提物對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最弱。

與化學物質(zhì)相比，灰樹花水提物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果大約介于氯化汞（0.3%）和青霉素（1.6× 105IU）之間，對大腸桿菌的抑菌效果和青霉素（1.6× 105IU）的抑菌效果接近，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與氯化汞（0.3%）的抑菌效果相當。

表3 灰樹花水提物的抑菌性能Table 3 Antimicrobial effects about water extract from G.frondosa

表4 四種化學物質(zhì)的抑菌性能Table 4 Antimicrobial effects about chemical substances

圖4 灰樹花水提物對三種細菌的抑菌圈Fig.4 Antibacterial circle of water extract from G.frondosa to bacteria

3 結論

目前市場上有多種以多糖為主要成分的保健品或藥品，但一般都價格昂貴，大眾難以接受?；覙浠ǘ嗵且灿型瑯拥谋＝『椭委煿δ埽易訉嶓w味道鮮美，因此可通過日常食用達到保護健康的目的。本研究結果認為溫度80℃、液料比60∶1、提取時間2.0h，可使灰樹花多糖盡量溶出，即平常食用時小火慢燉會更有利于食材的利用。

本研究表明灰樹花水提物有很好的抑菌效力，但灰樹花水提物成分復雜，不僅含有多糖，蛋白，礦質(zhì)離子，還含有揮發(fā)成分[11]。雖然真菌多糖也有一定的抑菌效果[12]，但其他小分子化合物如多酚類[13]也會有此功能，本研究中灰樹花水提物的具體抑菌成分還有待探討。

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Water extracts from Grifola frondosa and antimicrobial function

CHAI Rui-juan，SUN Chen
（College of Biochimcal Engineering of Anhui Polytechnic，Wuhu 241000，China）

The purpose of this research was to extract polysaccharide from Grifola frondosa，single factor and orthogonal tests were carried out.The method of phenol-sulfuric acid was used to determine the content of polysaccharide.Antibacterial performance test about water extracts was studied，too.Orthogonal tests showed that optimum conditions of polysaccharide extraction were as follows：extraction temperature 80℃，liquid ratio 60∶1（mL∶g）and extraction time 2.0h.Water extracts from G.frondosa had antibacterial activity to Bacillus subtilis，Escherichia coli and Staphylococcus aureus，and antibacterial circle were 8.74，10.23，12.42mm respectively.

Grifola frondosa；water extracts；orthogonal test；polysaccharide；antimicrobial function

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.059

2013－07－18

柴瑞娟（1975-），女，碩士研究生，副教授，主要從事微生物學方面的研究。