紅皮云杉原花青素的配合性質(zhì)及配合物的抗氧化活性研究

王 萍，鄭洪亮，騰 飛，鄭 影，王振宇，2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086）

紅皮云杉原花青素的配合性質(zhì)及配合物的抗氧化活性研究

王 萍1，鄭洪亮1，騰 飛1，鄭 影1，王振宇1，2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086）

研究了二次純化后的紅皮云杉球果原花青素與金屬離子（Fe2+、Zn2+）螯合、與蛋白質(zhì)大分子（牛血清蛋白）絡(luò)合反應(yīng)的條件?？疾炝嗽ㄇ嗨貪舛?、溫度和pH對(duì)配合反應(yīng)的影響，優(yōu)化了反應(yīng)條件，并進(jìn)一步通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)考察了配合體的性質(zhì)。結(jié)果表明，優(yōu)化后原花青素與Fe2+、Zn2+螯合率分別為89.12%±1.06%、88.31%±0.87%，與牛血清蛋白絡(luò)合率為91.78%±1.25%。原花青素經(jīng)過(guò)配合后其生物活性有一定的增強(qiáng)，且不同配合物的生物活性增強(qiáng)程度不同，但均具有較強(qiáng)的ABTS+·、DPPH·的清除能力和還原力，其濃度在一定范圍內(nèi)與清除能力呈量效關(guān)系。

紅皮云杉，原花青素，配合物，抗氧化活性

近年來(lái)，隨著人們對(duì)環(huán)境、生命健康水平等認(rèn)知程度的不斷提高，人們對(duì)天然產(chǎn)物提取物的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提出了更高的要求。尤其是植物原花青素，因其在植物界分布廣泛，生理功能多樣，來(lái)源豐富，已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的天然抗氧化劑之一[1]。原花青素的獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予其一系列獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)，使之具有抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能[2-3]，已應(yīng)用在包括食品、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域。

目前對(duì)原花青素的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但是對(duì)于原花青素與金屬離子的螯合反應(yīng)和與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿等生物大分子的絡(luò)合反應(yīng)的研究卻很少，而在這些反應(yīng)在現(xiàn)實(shí)中卻真實(shí)存在的。目前國(guó)內(nèi)在該方面的研究還很匱乏。根據(jù)中藥配位化學(xué)原理，中藥有機(jī)成分與微量元素結(jié)合后往往會(huì)提高其生物活性或產(chǎn)生新的生物活性。近來(lái)研究表明槲皮素與Fe2+、Pb2+、Cd2+等金屬離子形成配合物后生物活性和藥理作用明顯增強(qiáng)[4-7]，這對(duì)天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟了新的思路。

紅皮云杉（Picea koraiensis Nakai）是松科云杉屬常綠喬木，分布于東北小興安嶺，吉林山區(qū)海拔1400～1800m地帶。本實(shí)驗(yàn)以紅皮云杉球果原花青素的二級(jí)純化物為原料，探究其對(duì)金屬離子的螯合性能及對(duì)

蛋白質(zhì)生物大分子的絡(luò)合反應(yīng)能力，并對(duì)絡(luò)合產(chǎn)物進(jìn)行分離制備；同時(shí)采用抗氧化實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)復(fù)合反應(yīng)后配合物的抗氧化能力，旨在為天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 黑龍江省葦河林業(yè)局，采集時(shí)間為2011年9月份，將球果鱗片（去掉中間木質(zhì)軸）低溫干燥后粉碎過(guò)80目篩后-20℃密封冷凍，備用；DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）、Trolox（6-羥基-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-羧酸）、鄰二氮菲

Sigma公司；兒茶素（色譜級(jí)） 購(gòu)自上海源葉公司；FRAP試劑盒、ABTS試劑盒 上海碧云天試劑公司；本乙醇、蒸餾水、氯化亞鐵、鄰二氮菲、無(wú)水乙醇、氯化鋅、氯化鈣、香草醛、濃鹽酸、95%乙醇、濃硫酸、30%過(guò)氧化氫、甲醇 國(guó)產(chǎn)分析純。

RT-6000型酶標(biāo)儀 深圳雷社生命科技股份有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XW-80A型旋渦混合器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GZX-9240ME型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2004型上海電子天平 上海天平儀器廠；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī) 上?？婆d儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用香草醛-硫酸法[8]。 配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。精確移取1.0mL分別置于10mL試管中，加入2.5mL，4%香草醛-甲醇溶液和2.5mL的30%濃硫酸甲醇溶液，30℃水浴閉光靜置15min。以甲醇代替顯色劑為空白對(duì)照，500nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，平行測(cè)樣三次，取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與金屬離子的螯合反應(yīng) 紅皮云杉球果原花青素經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂D4020的一次純化，條件為：乙醇洗脫濃度為58%，上樣濃度為2.4mg/mL，徑高比為1∶26，洗脫流速為2.5mL/min；NKA-9大孔樹(shù)脂二次純化，條件為：上樣濃度：3.0mg/mL；洗脫劑：60%乙醇；徑高比：1∶25；洗脫劑pH：7，經(jīng)過(guò)兩次純化后純度為73.12%±1.25%，備用。

1.2.2.1 紅皮云杉原花青素二次純化物與Fe2+的鰲合能力測(cè)定[9]準(zhǔn)確量取1.0mL不同濃度紅皮云杉原花青素二次純化物于10mL比色管中，分別加入2.0mL 2mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后于37℃水浴中保持30min，之后加入0.1%鄰二氮菲溶液0.5mL，混合均勻后于37℃水浴中溫育10min，之后8000r/min離心10min，取上清液于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以等體積蒸餾水代替紅皮云杉原花青素二次純化物，其余方法相同測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；以等體積蒸餾水代替鄰二氮菲溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2，以扣除樣品本身的干擾。1%EDTA鰲合劑作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定方法同上。按照下式計(jì)算鰲合率，鰲合率表示加樣后Fe2+的減少量占總Fe2+的百分比：

式中：S：鰲合率，%；A1：混合物吸光度值；A2：上述體系中鄰二氮菲用等體積蒸餾水代替測(cè)定吸光度值；A0：上述體系中云杉樣品用等體積蒸餾水代替測(cè)定吸光度值。

1.2.2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與Zn2+鰲合能力測(cè)定 準(zhǔn)確量取0.5mL不同濃度的紅皮云杉原花青素二級(jí)純化物于10mL比色管中，分別加入2.0mL 0.015mmol/L的ZnCl2溶液，混合均勻后于37℃水浴中保持30min，之后4000r/min離心5min，取上清液1mL，利用香草醛-硫酸法測(cè)定上清液中原花青素濃度，按下式計(jì)算出螯合率：

式中：S：鰲合率，%；M0：反應(yīng)前樣品中原花青素的質(zhì)量，mg；M1：反應(yīng)后上清液中原花青素的質(zhì)量，mg。

1.2.3 紅皮云杉原花青素二次純化物與金屬離子（Fe2+、Zn2+）螯合單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 原花青素濃度對(duì)螯合能力的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法中定金屬離子的量，螯合溫度為40℃，pH為5，分別以3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的原花青素溶液反應(yīng)，根據(jù)Fe2+/Zn2+螯合能力測(cè)定方法，計(jì)算各單因素對(duì)螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.3.2 螯合溫度對(duì)螯合能力的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法中金屬離子的量，原花青素濃度8mg/mL，pH為5，分別以螯合溫度20、30、40、50、60、70、80℃反應(yīng)，根據(jù)Fe2+/Zn2+螯合能力測(cè)定方法，計(jì)算各單因素對(duì)螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.3.3 pH對(duì)螯合能力的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法中金屬離子的量，原花青素濃度8mg/mL，螯合溫度為40℃，分別以pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0反應(yīng)，根據(jù)Fe2+/Zn2+螯合能力測(cè)定方法，計(jì)算各單因素對(duì)螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.4 紅皮云杉原花青素二級(jí)純化物與牛血清蛋白的絡(luò)合反應(yīng)

1.2.4.1 紅皮云杉原花青素二級(jí)純化物與牛血清蛋白絡(luò)合能力測(cè)定 稱取牛血清蛋白，配制成濃度約1mg/mL的溶液。將原花青素二級(jí)純化物配制成不同濃度（1～8mg/mL），將0.8mL原花青素溶液分別添加到3.5mL牛血清蛋白溶液中，定容至5mL?；旌弦涸?5℃中水浴30min，使之形成多酚-蛋白質(zhì)絡(luò)合物。然后于8000r/min離心10min，取離心上清液1mL，用香草醛-硫酸法測(cè)定上清液中原花青素的量，參照Z(yǔ)n2+鰲合計(jì)算公式得出絡(luò)合率。

1.2.5 紅皮云杉原花青素二級(jí)純化物與牛血清蛋白絡(luò)合的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 原花青素濃度對(duì)絡(luò)合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡(luò)合反應(yīng)測(cè)定方法，螯合溫度為40℃，pH為5，分別以原花青素濃度1、2、3、4、5、6、7、8mg/mL反應(yīng)，計(jì)算各單因素對(duì)絡(luò)合率的影響，并繪制絡(luò)合曲線。

1.2.5.2 螯合溫度對(duì)螯合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡(luò)合反應(yīng)測(cè)定方法，原花青素濃度為3mg/mL，pH為5，分別以螯合溫度20、30、40、50、60、70、80℃反應(yīng)，計(jì)算各單因素對(duì)絡(luò)合率的影響，并繪制絡(luò)合曲線。

1.2.5.3 pH對(duì)螯合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡(luò)合反應(yīng)測(cè)定方法，原花青素濃度為3mg/mL，螯合溫度為40℃，分別以pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0反應(yīng)，計(jì)算各單因素對(duì)絡(luò)合率的影響，并繪制絡(luò)合曲線。

1.2.6 功能評(píng)價(jià)——原花青素復(fù)合體的抗氧化能力

1.2.6.1 原花青素復(fù)合體的制備 根據(jù)單因素中原花青素二級(jí)純化物螯合率曲線圖和絡(luò)合率曲線圖，在最佳復(fù)合條件下，制備原花青素螯合液和原花青素絡(luò)合液，分別用5%NaOH乙醇溶液調(diào)節(jié)pH，水浴回流攪拌，產(chǎn)生沉淀物，靜置冷卻后過(guò)濾，8000r/min離心10min分離，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，得到粗品，40℃干燥，用于抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.2 清除DPPH·作用 分別將原花青素復(fù)合體溶液配制成濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL的溶液。在10.0mL比色管中加入2.0mL樣品溶液，之后加入2.0mL 1×10-3mol/L DPPH·溶液（用95%乙醇配制），搖勻反應(yīng)30min后于517nm處測(cè)定吸光值，以2.0mL無(wú)水乙醇與2.0mL樣品液作參比，測(cè)定吸光值A(chǔ)，同時(shí)以乙醇溶液為參比測(cè)定DPPH·空白溶液吸光度值A(chǔ)0，用Trolox作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)[10]。清除率計(jì)算公式如下：

以清除率對(duì)樣品濃度進(jìn)行回歸處理，計(jì)算出配合物的半數(shù)抑制濃度（IC50）數(shù)值。

1.2.6.3 總抗氧化能力的測(cè)定（FRAP法）標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備及總抗氧化能力的測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.6.4 清除ABTS+自由基作用 樣品的測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。計(jì)算公式如下：

其中：A1為加測(cè)定溶液后ABTS+·的吸光值；A2為測(cè)定溶液在734nm波長(zhǎng)下的吸光值；A3為未加測(cè)定溶液時(shí)ABTS+·的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝2.1658x+0.0178，R2=0.9995。

2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與Fe2+的鰲合實(shí)驗(yàn)

2.2.1 原花青素濃度對(duì)螯合能力的影響 由圖2可知，隨著原花青素反應(yīng)濃度的增大，參與反應(yīng)的原花青素逐漸增多，螯合率也隨之增大[13]，當(dāng)原花青素的濃度增大到8mg/mL時(shí)，溶液中的金屬離子Fe2+完全參加反應(yīng)，增大原花青素濃度，螯合率基本穩(wěn)定，故與Fe2+螯合的最適原花青素濃度為8mg/mL。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Catechin standard curve

圖2 原花青素濃度對(duì)原花青素與Fe2+螯合的影響Fig.2 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

2.2.2 溫度對(duì)螯合能力的影響 由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，20～30℃時(shí)，螯合率呈上升趨勢(shì)，溫度的增大明顯促進(jìn)鰲合反應(yīng)；當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，隨著溫度上升，螯合率與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，直到80℃時(shí)降至5.64%，可能是由于隨著溫度的升高，原花青素的降解加速，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)中參與螯合反應(yīng)的原花青素減少[14]。故選擇30℃為螯合溫度。

圖3 溫度對(duì)原花青素與Fe2+螯合的影響Fig.3 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

2.2.3 pH對(duì)螯合能力的影響 由圖4可知，隨著反應(yīng)體系的pH的變化，在pH為2～6時(shí)，螯合率呈上升趨勢(shì)，pH的增大明顯促進(jìn)了鰲合反應(yīng)；當(dāng)pH超過(guò)6時(shí)，隨著pH上升（堿性增強(qiáng)），螯合率明顯下降，因此，原花青素與Fe2+的螯合反應(yīng)進(jìn)行的最適體系pH為6。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在原花青素濃度為8mg/mL，溫度為30℃，pH為6時(shí)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到螯合率為89.12%±1.06%。

2.3 紅皮云杉原花青素二次純化物與Zn2+的鰲合實(shí)驗(yàn)2.3.1 原花青素濃度對(duì)螯合能力的影響 由圖5可知，隨著反應(yīng)體系中原花青素濃度增大，在原花青素的濃度在1～5mg/mL時(shí)，螯合率基本不變，這是因?yàn)榇藭r(shí)Zn2+是過(guò)量的，體系中固定可反應(yīng)比例的原花青素全部參與螯合反應(yīng)；當(dāng)原花青素濃度超過(guò)5mg/mL時(shí)，螯合率逐漸下降，這是因?yàn)轶w系中的Zn2+不足，原花青素過(guò)剩。從節(jié)省原料角度出發(fā)，原花青素與Zn2+螯合反應(yīng)的最佳濃度為5mg/mL。

圖4 pH對(duì)原花青素和Fe2+螯合的影響Fig.4 Effect of pH on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

圖5 原花青素濃度對(duì)原花青素與Zn2+螯合的影響Fig.5 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Zn2+

2.3.2 溫度對(duì)螯合能力的影響 由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，螯合率在20～40℃時(shí)，溫度升高，反應(yīng)速率加快，螯合率逐漸增大；當(dāng)溫度超過(guò)40℃后，螯合率開(kāi)始下降，可能是由于溫度較高，原花青素開(kāi)始降解，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)中參與螯合的原花青素逐漸減少[15]，當(dāng)溫度超過(guò)70℃后，螯合率下降速率增大，溶液中原花青素被大量破壞，此時(shí)螯合率降至最低30.38%，故螯合溫度為40℃。

2.3.3 pH對(duì)螯合能力的影響 由圖7可知，隨著反應(yīng)體系的pH的變化，在pH為2～3時(shí)，螯合率變化不大；當(dāng)pH=4時(shí)，螯合率達(dá)到了最大61.34%；當(dāng)pH超過(guò)4時(shí)，隨著pH上升，螯合率明顯下降。因此原花青素與Zn2+的螯合反應(yīng)進(jìn)行的最適體系pH為4。

圖6 溫度對(duì)原花青素與Zn2+螯合的影響Fig.6 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Zn2+

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在原花青素濃度為5mg/mL，溫度為40℃，pH為4時(shí)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到螯合率為88.31%±0.87%。

2.4 紅皮云杉原花青素二次純化物與牛血清蛋白的絡(luò)合實(shí)驗(yàn)

2.4.1 原花青素濃度對(duì)絡(luò)合能力的影響 由圖8可知，原花青素的濃度在1～3mg/mL范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)體系中原花青素濃度增大，體系中固定可反應(yīng)比例的原花青素全部參與絡(luò)合反應(yīng)，絡(luò)合率基本不變；當(dāng)原花青素濃度超過(guò)3mg/mL時(shí)，體系中的牛血清蛋白不足，原花青素剩余，則絡(luò)合率逐漸下降。從節(jié)省原料角度出發(fā)，原花青素與牛血清蛋白絡(luò)合反應(yīng)的最佳濃度為3mg/mL。

圖8 原花青素濃度對(duì)原花青素與牛血清蛋白的絡(luò)合影響Fig.8 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

2.4.2 溫度對(duì)絡(luò)合能力的影響 由圖9可知，隨著體系溫度的上升，絡(luò)合率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在20～30℃下，溫度對(duì)絡(luò)合率的影響情況相同，在此溫度下，絡(luò)合率相近。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，絡(luò)合率達(dá)到最大值，說(shuō)明牛血清蛋白在該溫度下穩(wěn)定性較好，能很好的與原花青素進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)[16]。隨著溫度繼續(xù)上升，絡(luò)合率呈下降趨勢(shì)，是由于在高溫下牛血清蛋白逐漸發(fā)生變性，原花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生不利變化[17]，導(dǎo)致絡(luò)合作用受到影響，說(shuō)明高溫不利于原花青素和牛血清蛋白絡(luò)合反應(yīng)的進(jìn)行。因此，原花青素與牛血清蛋白絡(luò)合溫度為40℃。

圖9 溫度對(duì)原花青素與牛血清蛋白絡(luò)合的影響Fig.9 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

2.4.3 pH對(duì)絡(luò)合能力的影響 由圖10可知，隨著反應(yīng)體系的pH的變化，在pH為2～6時(shí)，絡(luò)合率呈上升狀態(tài)；當(dāng)pH=6時(shí)，絡(luò)合率達(dá)到了最大值85.61%；當(dāng)pH超過(guò)6時(shí)，隨著pH上升（堿性增強(qiáng)），絡(luò)合率明顯下降，因此，原花青素與牛血清蛋白的絡(luò)合反應(yīng)進(jìn)行的最適體系pH為6。

圖10 pH對(duì)原花青素與牛血清蛋白的絡(luò)合影響Fig.10 Effect of pH on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，原花青素濃度為3mg/mL，溫度為40℃，pH為6時(shí)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到絡(luò)合率為（91.78± 1.25）%。

2.5 紅皮云杉原花青素配合物體外抗氧化活性研究

2.5.1 紅皮云杉原花青素配合物清除ABTS+自由基能力的測(cè)定 由圖11可知，紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對(duì)ABTS+自由基均有清除作用，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的受試物濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，對(duì)ABTS+自由基清除的能力逐漸增強(qiáng)。

由結(jié)果分析表1可知，各線性模擬方程的關(guān)系系數(shù)R2＞0.93，說(shuō)明濃度對(duì)清除率的線性關(guān)系很好；由IC50值可知，樣品對(duì)ABTS+自由基清除能力順序?yàn)椋篢rolox＞原花青素-牛血清蛋白＞原花青素-鋅＞原花青素-鐵（Ⅱ）＞原花青素。說(shuō)明原花青素經(jīng)配合后其清除ABTS+自由基的能力有一定的增強(qiáng)。

2.5.2 紅皮云杉原花青素配合物清除DPPH自由基能力的測(cè)定 由圖12可知，紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對(duì)DPPH自由基均有清除作用，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的受試物濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除的能力逐漸增強(qiáng)。

圖11 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對(duì)ABTS+自由基清除作用Fig.11 ABTS radical scavenging activity of proanthocyanidins，coordinated complexes and Trolox

圖12 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.12 DPPH radical scavenging activity of proanthocyanidins，Coordinated complexes and Trolox

表1 抗氧化結(jié)果分析Table 1 Analysis of antioxidant results

表2 抗氧化結(jié)果分析Table 2 Analysis of antioxidant results

表3 抗氧化結(jié)果分析Table 3 Analysis of antioxidant results

由結(jié)果分析表2可知：線性模擬方程的關(guān)系系數(shù)R2＞0.93，說(shuō)明濃度對(duì)清除率的線性關(guān)系較好；由IC50值可知，樣品對(duì)DPPH自由基清除能力順序?yàn)椋篢rolox＞原花青素-鐵（Ⅱ）＞原花青素-鋅＞原花青素-牛血清蛋白＞原花青素。說(shuō)明原花青素經(jīng)配合后，其清除DPPH自由基的能力有不同程度的增強(qiáng)。

2.5.3 紅皮云杉原花青素配合物總還原能力的測(cè)定

由圖13可知，三種原花青素配合物均有一定的還原能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加還原能力增加。由表3可知，相關(guān)系數(shù)R2較大，均大于0.99，說(shuō)明Trolox、原花青素-鋅、原花青素-鐵（Ⅱ）、原花青素、原花青素-牛血清蛋白的還原能力與濃度之間呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。由半效濃度值（EC50值）可知，原花青素與金屬離子配合后，還原能力增強(qiáng)；與牛血清蛋白配合后，還原能力稍有增強(qiáng)。

圖13 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox總還原能力Fig.13 Reducing power of proanthocyanidins，coordinated complexes and Trolox

3 討論

原花青素是一種良好的氧游離基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑。可有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基[18-20]，也參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過(guò)氧化損傷[21]。有研究表明，化合物結(jié)構(gòu)具有較高的超離域度、完整的大P鍵共軛體系、強(qiáng)配位氧原子與合適的空間構(gòu)型、可作為金屬離子的良好螯合配體，大部分金屬離子最外層都有空軌道，可以形成穩(wěn)定的配合物[22]。李方等[23]合成了槲皮素鋅、銅和鐵配合物，稱金屬離子與有機(jī)活性配體協(xié)同作用可提高其抗氧化活性的能力。原花青素為強(qiáng)有力的金屬螯合劑[24]，可螯合金屬離子，將原花青素類化合物與人體必需金屬元素形成配合物，并發(fā)揮其抗活性氧自由基的協(xié)同增效作用是較為全新的研究領(lǐng)域[25]，而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了金屬離子、牛血清蛋白與紅皮云杉球果原花青素配位后抗氧化性增強(qiáng)，而這一研究對(duì)天然藥物的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟了新的途徑。

4 結(jié)論

原花青素與Fe2+螯合的最佳條件為：原花青素濃度為8mg/mL，溫度為30℃，pH為6，在該條件下得到螯合率為89.12%±1.06%。原花青素與Zn2+螯合的最佳條件：原花青素濃度為5mg/mL，溫度為40℃，pH為4，在該條件下得到的螯合率為88.31%±0.87%。原花青素與牛血清蛋白絡(luò)合的最佳條件：原花青素濃度為3mg/mL，溫度為40℃，pH為6。在該最佳條件下得到的絡(luò)合率為91.78%±1.25%。原花青素與Fe2+、Zn2+、牛血清蛋白的配合體，清除ABTS+·、DPPH·的能力和還原力較原花青素均有一定程度的增強(qiáng)，其中金屬離子配合物增強(qiáng)效果較明顯。

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Coordination characteristics of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones and the antioxidant activity of the coordination compound

WANG Ping1，ZHENG Hong-liang1，TENG Fei1，ZHENG Ying1，WANG Zhen-yu1，2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150086，China）

The coordination of second purified proanthocyanidins with Fe2+，Zn2+and bovine serum albumin was studied.The effect of proanthocyanidins concentration，temperature and pH on coordination characteristics was investigated and the coordination conditions were optimized.The antioxidant activity of the coordination compound was evaluated.Results showed that the rate of proanthocyanidins coordinated with Fe2+，Zn2+and bovine serum albumin was 89.12%±1.06%，88.31%±0.87%and 91.78%±1.25%respectively under the optimized conditions.The physiological activity of proanthocyanidins increased after coordinated.The activity of scavenging free radicals and reducing power were enhanced.A dose-response relation between concentrations and antioxidant activity was found，for which a good development prospects was expected.

Picea koraiensis Nakai；proanthocyanidins；coordinated complexes；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0276-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.054

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

王萍（1964-），女，教授，研究方向：功能性植物資源的開(kāi)發(fā)與利用。

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（31170510）。