南極磷蝦殼中蝦青素酯的皂化工藝研究

姜啟興，宋素梅，夏文水，劉富俊，許艷順，劉冬梅，王海鷗，*

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連116113）

南極磷蝦殼中蝦青素酯的皂化工藝研究

姜啟興1，宋素梅1，夏文水1，劉富俊2，許艷順1，劉冬梅2，王海鷗1，*

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2．遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧大連116113）

研究了南極磷蝦殼中蝦青素酯的皂化條件，以游離蝦青素含量為指標，分析了粗提液濃度、皂化溫度和堿濃度對皂化效果的影響。結(jié)果表明，粗提液濃度在0.1g/mL時，完成皂化所需的時間和堿濃度較為合適；皂化溫度和堿濃度越高，完成皂化所需的時間越短，而損失也越大。最適皂化條件為，粗提液濃度0.1g/mL、皂化溫度5℃、堿濃度0.020mol/L，皂化時間12h時，此條件下游離蝦青素含量為55.75μg/mL。

南極磷蝦殼，蝦青素酯，皂化，蝦青素

近年來，隨著資源問題的日益嚴峻，遠洋資源的開發(fā)利用成為各國爭相研究的課題。據(jù)估計，南極磷蝦的生物量為10.00億噸，幾乎遍布整個南極海域，資源極其豐富[1]。而蝦青素是南極磷蝦殼中含量比較豐富的活性成分，具有比較活躍的電子效應(yīng)，極易與自由基反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)的活性氧，具有超強的抗氧化活性。此外，蝦青素還具有抗癌、增強免疫、促進生長繁殖等作用以及顯著的著色能力，在食品、醫(yī)藥、化妝品和飼料等行業(yè)具有重要作用。目前，國內(nèi)研究更多的關(guān)注在于南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應(yīng)用[2]，國外則側(cè)重于對酶、脂肪酸等的分離純化及其性質(zhì)分析[3-4]，對南極磷蝦殼資源的研究較少。而蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發(fā)利用。

研究表明，蝦青素主要以游離蝦青素和蝦青素酯的形式存在于蝦殼中，約占蝦殼中總類胡蘿卜素的63.5%～92.2%，因蝦種類而異[5]。通過皂化反應(yīng)將蝦青素酯轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，是分離純化蝦青素，提高最終蝦青素產(chǎn)品得率的重要手段。然而皂化條件控制不當，反而會引起蝦青素的大量損失。因此，本文重點對影響蝦青素得率的皂化條件進行研究，以獲得較好的皂化工藝，減少皂化過程蝦青素的降解損失。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南極磷蝦 由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司提供，經(jīng)采肉機采肉3次后得蝦殼備用，用丙酮提取蝦青素，溶劑蒸干后得到粗提的蝦青素色素油[6]；蝦青素標準樣品（純度≥97.1%） 德國Dr.Ehrenstorferg公司；丙酮、石油醚、乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純；二氯甲烷、甲醇、乙腈 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

UV1000分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；薄層層析硅膠板（2.5cm×7.5cm） 山東青島海洋化工有限公司；Waters1525高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱Spherisorb?Silica（4.6mm× 250mm，5μm） 美國Waters公司；RZ-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 配有SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；AB104-N電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦青素酯的皂化流程 蝦青素色素油→復(fù)溶→加皂化液→氮氣頂吹→凈置皂化。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 粗提液濃度對皂化效果的影響 粗提的蝦青素色素油用無水乙醇溶解，分別配成色素油含量為0.05、0.1、0.2g/mL的粗提液5mL置于具塞試管中，分別加入1mL不同濃度（0.01、0.02、0.03、0.04mol/L）的NaOH-乙醇溶液，混勻，氮氣吹掃至總體積5mL，于5℃避光靜置。以正己烷-丙酮為展開劑（體積比75∶25）[7]，利用薄層層析板至少每0.5h檢測一次，皂化液在薄層板上僅出現(xiàn)一個總類胡蘿卜素點，且該點的Rf值與蝦青素標樣相同時，即為皂化終點，記錄皂化時間。

1.2.2.2 皂化溫度對游離蝦青素含量的影響 取色素油含量0.1g/mL（總類胡蘿卜素含量約72.5μg/mL）的粗提液5mL置于具塞試管中，加入0.020mol/L新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，混勻，氮氣吹掃至總體積5mL，分別置于5、15、25℃避光靜置，每隔1h用HPLC測定游離蝦青素的含量[8-9]。

1.2.2.3 堿濃度對游離蝦青素含量的影響 取色素油含量0.1g/mL的粗提液5mL置于具塞試管中，加入新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，濃度分別為0.014、0.017、0.020、0.023mol/L，混勻，氮氣吹掃至總體積5mL，5℃避光靜置，每隔1h測定游離蝦青素的含量。每個樣品平行3次。

1.2.2.4 皂化液中蝦青素的穩(wěn)定性 取色素油含量0.1g/mL的粗提液5mL于具塞試管中，加入0.020mol/L新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，混勻，氮氣吹掃至總體積5mL，于5℃避光靜置12h，然后將皂化液分別置于5℃和25℃條件下避光保藏，每隔6h用HPLC測定游離蝦青素含量。每個樣品平行3次。

1.2.3 蝦青素的測定 用高效液相色譜法分析蝦青素的含量，色譜條件如下[10]：

色譜柱：Ecosil反相C18柱（4.6mm×250mm）；流動相：包括A和B，其中A為二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水（5.0∶85.0∶5.5∶4.5），B為二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水（22.0∶28.0∶45.5∶4.5）；梯度洗脫：0%B洗脫8min，0%～100%的B洗脫24min；流速0.8mL/min；柱溫30℃；檢測器：DAD，即二極管陣列檢測器；進樣量5μL；檢測波長476nm（DAD掃描結(jié)果）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS18（Statistical Product and Service Solutions）軟件；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素標準曲線

配制不同濃度的蝦青素標準品，用高效液相色譜法分析蝦青素含量，并繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可見蝦青素的含量與峰面積成正比，將標準曲線回歸方程進行轉(zhuǎn)化，可以得到蝦青素含量的方程為：蝦青素含量（μg/mL）=0.00812A+0.745，R2= 0.9964，式中A為峰面積（mAU·s）。

圖1 蝦青素標準曲線Fig.1 The standard curve of astaxanthin

2.2 粗提液濃度對皂化效果的影響

在皂化過程中，利用薄層層析法分析皂化液可以對皂化過程進行直觀、方便的跟蹤檢測。

圖2 粗提液皂化前后的薄層色譜圖Fig.2 TLC of crude extract before and after saponification

由圖2可知，隨著皂化反應(yīng)的進行，Rf為0.43和0.14的總類胡蘿卜素斑點變淡甚至消失，說明蝦青素酯轉(zhuǎn)化成了游離蝦青素。根據(jù)薄層色譜圖上色帶的顯示情況，可直觀分析不同條件下的皂化過程，確定堿液的濃度范圍和皂化所需的時間。

表1 不同粗提液濃度和堿濃度時的皂化時間（h）Table 1 The saponification time at different crude extract and alkali concentration

如表1所示，隨著粗提液濃度的增大，24h內(nèi)完成皂化所需的堿濃度液也逐漸增大。粗提液濃度為0.05、0.10、0.20、0.30g/mL，堿濃度為0.01、0.02、0.03、0.04mol/L時；分別需要10.0、12.0、20.0、15.0h才能使粗提液中的蝦青素酯完全轉(zhuǎn)化為游離蝦青素。粗提液濃度較低時，在薄層板上的顯色不明顯，也會增大高效液相色譜分析時的誤差，同時不利于后期的分離；粗提液濃度過高，不易完全溶于乙醇溶液，且皂化時需提高堿液濃度和延長時間，容易導(dǎo)致色素的氧化損失。因此，綜合考慮選擇粗提液濃度為0.1g/mL。

2.3 皂化溫度對游離蝦青素含量的影響

溫度是影響化學(xué)反應(yīng)的重要因素，圖3為5、15、25℃條件下皂化時，游離蝦青素的含量變化情況。隨著溫度的升高，皂化反應(yīng)的起始速度較快，游離蝦青素含量達到最高值時所需的時間變短，然而最高含量相對較低。這與陳興才等[11-12]利用KOH皂化研究結(jié)果是類似的，溫度越高，皂化速度越快，但是蝦青素氧化損失加劇，而他們的研究采用的堿液濃度較高，此而皂化時間較短。由圖3可見，5、15、25℃下皂化蝦青素的最高含量分別55.75、53.85、50.95μg/mL，而所需的時間分別為12、7、5h。這表明高溫雖然能夠加快反應(yīng)速度，同時也會造成蝦青素的降解或氧化損失。因此，選擇皂化溫度為5℃。

圖3 皂化溫度對游離蝦青素含量的影響Fig.3 Effect of saponification temperature on the content of free astaxanthin

2.4 堿濃度對游離蝦青素含量的影響

堿液濃度也是影響皂化的主要因素，如圖4所示，在皂化反應(yīng)的起始階段，堿濃度越高，皂化液中游離蝦青素的增速越大。然而堿濃度過高，所得游離蝦青素的總量較低，如0.023mol/L時，5h即可完全皂化，游離蝦青素含量最大僅為52.85μg/mL，這可能由于堿濃度過高導(dǎo)致蝦青素氧化損失加劇；但是堿濃度過低，皂化速度太慢，如0.014mol/L時，12h尚未完成皂化反應(yīng)；堿濃度0.020mol/L，12h時游離蝦青素的含量最高，為55.75μg/mL，12～13h時含量基本不變。因此，選擇所添加NaOH-乙醇溶液的濃度為0.020mol/L。

2.5 皂化液中蝦青素的穩(wěn)定性

為探索5℃條件下皂化12h后，皂化液中的游離蝦青素含量的穩(wěn)定性，分別將皂化液放置于5℃和25℃避光靜置，分析游離蝦青素含量隨放置時間的變化。

圖4 堿濃度對游離蝦青素的含量的影響Fig.4 Effect of alkali concentration on the content of free astaxanthin

圖5 放置時間對游離蝦青素含量的影響（5、25℃）Fig.5 Effect of storage time on the content of free astaxanthin（5、25℃）

由圖5所示，0～12h的蝦青素含量為粗提液在5℃條件下的皂化情況。12h之后，為將5℃下皂化液分別置于5℃和25℃下放置游離蝦青素含量變化情況。由圖5可見隨著時間的延長游離蝦青素含量逐漸降低，其中25℃條件下游離蝦青素含量下降較快，如30h時的含量為50.0μg/mL，低于5℃下的54.1μg/mL。48h時，5℃和25℃下游離蝦青素的含量分別為49.8μg/mL和41.6μg/mL。這主要是由于蝦青素溫度穩(wěn)定性與在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性有關(guān)，這與先前報道的蝦青素在較高的溫度下、在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差是一致的[13]。因此皂化完成后應(yīng)低溫保藏或盡快進行后續(xù)的分離操作。

2.5 蝦青素粗提液皂化前后的成分比較分析

如圖6所示為粗色素油含量0.1g/mL的粗提液（總類胡蘿卜素含量約72.5μg/mL）在5℃條件下皂化12h前后的情況。圖6（a）為粗提液的高效液相色譜圖，游離蝦青素峰面積（mAU·s）為3572.7，根據(jù)蝦青素標準曲線方程可得，粗提液中游離蝦青素含量為29.76μg/mL。圖6（b）為粗提液皂化后的高效液相色譜圖，游離蝦青素峰面積（mAU·s）為6774.0，根據(jù)蝦青素標準曲線方程可得，皂化后粗提液中游離蝦青素含量為55.75μg/mL。

3 結(jié)論

隨著皂化溫度的升高，皂化初始速度提高，但達到蝦青素的最高濃度下降；而隨著堿液濃度的提高皂化速度提高，但濃度太高蝦青素穩(wěn)定性下降；皂化完成后色素在皂化體系中穩(wěn)定性較差。因此，綜合各因素得到適宜的皂化條件為：粗提液色素油含量0.1g/mL、皂化溫度5℃、NaOH-乙醇濃度0.020mol/L，皂化時間12h，此條件下游離蝦青素含量為55.75μg/mL。

[1]Atkinson A，Siegel V，Pakhomov E A，et al.A re-appraisal ofthe total biomass and annual production of Antarctic krill[J]. Deep-Sea Research I，2009，56（5）：735.

圖6 粗提液皂化前（a）后（b）的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of crude extract before（a）and after saponification（b）

[2]任艷．南極磷蝦蛋白加工利用的初步研究[D]．青島：中國海洋大學(xué)，2009．

[3]Johan Sjodahl，Asa Emmer，Bjorn Karlstam，et al.Separation of proteolytic enzymes originating from Antarctic krill（Euphausia superba）bycapillaryelectrophoresis[J].Journal of Chromatography B，1998，705（2）：231-241.

[4]Joseph C G，Matthew P D，Sarah K B，et al.Extraction and characterisation oflipids from Antarctic krill（Euphausia superba）[J].Food Chemistry，2011，125（3）：1028-1036.

[5]Sachindra N M，Bhaskar N，Mahendrakar N S.Carotenoids in different body components of Indian shrimps[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2005，85（1）：167-171.

[6]Sachindra N M，Bhaskar N，Mahendrakar N S.Recovery of carotenoids from shrimp waste in organic solvents[J].Waste Management，2006，26（10）：1092-1098.

[7]Birkeland S，Bjerkeng B.Extractabilities of astaxanthin and protein from muscle tissue of Atlantic salmon（Salmo salar）as affected by brine concentration and pH[J].Food Chemistry，2004，85（4）：559-568.

[8]趙儀.蝦殼蝦青素提取與純化研究[D].福州：福州大學(xué)，2006.

[9]孫偉紅，肖榮輝，冷凱良，等.雨生紅球藻中蝦青素的C30-反相高效液相色譜法測定[J].分析測試學(xué)報，2010，29（8）：841-845.

[10]Yuan J，Chen F.Purification of trans-astaxanthin from a high-yielding astaxanthin ester-producing strain of the microalga Haematococcus pluvialis[J].Food Chemistry，2000，68（4）：443-448.

[11]陳興才，賴虔，趙儀.蝦殼蝦青素酯皂化工藝研究[J].中國食品學(xué)報，2007，7（4）：74-79.

[12]陳興才，黃偉光，歐陽琴.雨生紅球藻中蝦青素酯的皂化及游離蝦青素的純化分離[J].福州大學(xué)學(xué)報，2005，33（2）：264-268.

[13]宋素梅，劉富俊，姜啟興，等.南極磷蝦蝦殼中蝦青素穩(wěn)定性的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（18）：96-98.

Study on the saponification technique of astaxanthin esters from Antarctic krill shells

JIANG Qi-xing1，SONG Su-mei1，XIA Wen-shui1，LIU Fu-jun2，XU Yan-shun1，LIU Dong-mei2，WANG Hai-ou1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group，Dalian 116113，China）

Saponification conditions of astaxanthin esters from Antarctic krill shells were studied，and effects of pigment concentration，saponification temperature and alkali concentration on saponification were determined by taking free astaxanthin as index.Results showed that when the crude extract concentration was 0.1g/mL，the time and alkali concentration required to complete the saponification were appropriate.The time required to complete the saponification was shorter when the temperature and alkali concentration were higher，but the loss was greater.The most suitable saponification conditions were crude extract concentration 0.1g/mL，saponification temperature 5℃，alkali concentration 0.020mol/L and 55.75μg/mL of free astaxanthin was obtained at 12h of saponification.

Antarctic krill shells；astaxanthin ester；saponification；astaxanthin

TS209

B

1002-0306（2014）08-0233-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.044

2013－08－05 *通訊聯(lián)系人

姜啟興（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工與保藏。

“十二五”國家“863”計劃項目（2011AA090801）。