響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取工藝研究

張琳杰，彭 勝，張昌偉，王志宏，周云雷，彭密軍，*，張水寒

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，杜仲湖南省工程實驗室，湖南張家界427000；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥新藥研究與開發(fā)重點實驗室，湖南長沙410013）

響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取工藝研究

張琳杰1，彭 勝1，張昌偉1，王志宏1，周云雷1，彭密軍1，*，張水寒2

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，杜仲湖南省工程實驗室，湖南張家界427000；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥新藥研究與開發(fā)重點實驗室，湖南長沙410013）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取工藝?？疾炝颂崛∪軇?、液料比、提取時間、提取溫度及提取次數(shù)對提取工藝的影響，在單因素實驗分析的基礎(chǔ)上采用Box-Benhnken中心組合進行4因素3水平的實驗設(shè)計，以總多酚得率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，建立二次多項回歸數(shù)學(xué)模型，并優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取最佳工藝為：55%乙醇、液料比為25∶1mL·g-1、45℃下提取25min，提取兩次，在此條件下，總多酚得率為4.678%。

杜仲葉，總多酚，超聲波輔助提取，響應(yīng)面法

杜仲為我國名貴的滋補中藥之一，具有降血壓[1-2]、補肝腎[3-4]、強筋骨[5-6]等諸多功效，杜仲葉是我國衛(wèi)生部審批通過的藥食兩用類植物，其內(nèi)含有多種活性成分，如黃酮類[7]、以綠原酸為主的苯丙素類物質(zhì)[8]、木脂素類[9]、環(huán)烯醚萜類[10]等，其中黃酮和綠原酸從其結(jié)構(gòu)上又可歸為植物多酚類化合物。植物多酚具有較強的清除自由基、抗衰老、抗輻射、抗菌、殺菌等作用[11-14]，被稱為“第七類營養(yǎng)素”，在食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)等具有廣闊的市場前景。杜仲葉中總多酚提取物可用作諸多行業(yè)生產(chǎn)的功效成分。目前已有以杜仲葉浸提液與桑葉、五味子、山楂等植物提取物等為原料配制各種具有不同功能保健食品的文獻報道[15-17]，但是杜仲葉中總多酚提取的相關(guān)報道則較少。為保證杜仲葉浸提液中多酚類物質(zhì)含量的最大化，本實驗考察了杜仲葉中總多酚的提取工藝。

總多酚的提取方法主要有超聲波輔助法、微波輔助法、酶法等，其中超聲波輔助提取方法具有操作簡便、提取率高、能耗低且不破壞被提取物結(jié)構(gòu)等諸多優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于天然植物有效成分的提取。杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取工藝受諸多因素的影響，且各因素之間還可能存在著交互作用，因此本實驗應(yīng)用響應(yīng)面法對該工藝條件進行分析與優(yōu)化，考察提取溶劑、液料比、提取溫度、提取時間等因素影響總多酚提取的變化規(guī)律及各因素之間的交互作用，以期獲得杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取的優(yōu)化工藝條件，為杜仲葉的綜合開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 于2012年9月份采于吉首大學(xué)張家界校區(qū)杜仲實驗基地，經(jīng)吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為杜仲科杜仲屬植物，樣品采集后微波殺青50℃烘干，粉碎過80目篩，裝袋置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆?；甲醇?5%乙醇 AR，上海恒興（集團）有限公司；沒食子酸 Gallic acid（GA），≥98%，張家界奧威科技有限公司；福林酚試劑 Folin-Ciocalteu’s phenol Reagent（FC），BR，上海藍季科技發(fā)展有限公司；無水碳酸鈉 AR，成都市科龍試劑化工廠；實驗所用水 均為蒸餾水。

UV-3900紫外-可見分光光度計 日本HITACHI；AEG-220萬分之一天平 日本SHIMADZU；WD-700微波爐 樂金電子（天津）電器有限公司；GZX-9146數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SB-25-12DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉總多酚提取工藝 提取工藝流程如下：杜仲葉→干燥→粉碎→過80目篩→超聲波輔助提取→過濾→測定吸光度→計算總多酚得率。

1.2.2 多酚標準曲線的建立 以沒食子酸為對照品，F(xiàn)C（Folin-Ciocalteu，福林酚）比色法[18]測定系列標準溶液的吸光度A，以標準溶液濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，并計算樣品中總多酚含量。標準曲線方程為：A=0.0135C+0.0196，R2= 0.9991。

1.2.3 多酚的計算公式 以總多酚得率為指標考察單因素及響應(yīng)面實驗結(jié)果，總多酚得率計算公式如下：Y（%）=W1/W2×100，式中，Y為總多酚得率，W1為提取液中總多酚質(zhì)量，W2為稱取杜仲葉質(zhì)量。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

1.2.4.1 提取溶劑的單因素實驗 由于多酚類化合物均含有多個羥基，極性較大，因此選擇水、甲醇、乙醇為溶劑進行提取。準確稱取0.5g樣品，分別加入10.0mL體積分數(shù)為0%（蒸餾水）、10%、30%、50%、70%、90%甲醇、乙醇溶液，25℃下提取30min，提取兩次，合并兩次提取液并定容于50mL容量瓶，考察溶劑對總多酚得率的影響。

1.2.4.2 液料比的單因素實驗 準確稱取0.5g樣品，按液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1mL·g-1加入相應(yīng)體積的50%乙醇溶液，25℃下超聲提取30min，提取兩次，計算不同液料比下總多酚得率。

1.2.4.3 提取溫度的單因素實驗 準確稱取0.5g樣品，加入10.0mL 50%乙醇，分別在25、35、45、55和65℃下提取30min，提取兩次，計算不同溫度下總多酚得率。

1.2.4.4 提取時間的單因素實驗 準確稱取0.5g樣品，加入10.0mL 50%乙醇，25℃下分別提取15、20、25、30、35min，提取兩次，計算不同提取時間下總多酚得率。

1.2.4.5 提取次數(shù)的單因素實驗 準確稱取0.5g樣品，加入10.0mL 50%的乙醇，25℃下超聲提取30min，分別提取1、2、3、4、5次，濾液定容于50mL容量瓶，計算不同提取次數(shù)下總多酚得率。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定影響杜仲葉中總多酚得率較為顯著的因素，即提取溶劑、液料比、提取溫度及提取時間，以總多酚得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計法優(yōu)化杜仲葉中總多酚提取工藝條件，各因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

采用Design-Expert 8.0進行響應(yīng)面實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，其余數(shù)據(jù)利用EXCEL 2007進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 提取溶劑對總多酚得率的影響Fig.1 The influence of extraction solvents on the yield of total polyphenols

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對總多酚得率的影響 提取溶劑對超聲波提取的影響如圖1所示，隨著溶劑濃度的增加，使用甲醇體系與乙醇體系進行提取所得總多酚得率變化趨勢基本一致，均為先增長后降低，其中50%乙醇提取所得總多酚得率最大。其主要原因是杜仲葉中總多酚與50%乙醇極性最為接近，在其中溶解度最大，故以體積分數(shù)為50%的乙醇作為提取溶劑為較優(yōu)選擇。

2.1.2 液料比對總多酚得率的影響 液料比對超聲波提取的影響如圖2所示，隨著溶劑用量的增加，總多酚得率隨之提高，當(dāng)液料比超過20∶1mL·g-1時總多酚的得率反而下降，這可能是因為當(dāng)液料比達到20∶1mL·g-1時杜仲葉中的總多酚在提取溶劑中的溶出已基本達到動態(tài)平衡，繼續(xù)增大液料比不僅會增加其他雜質(zhì)的溶出，還會增大后續(xù)回收溶劑的工作量。因此確定20∶1mL·g-1的液料比較適宜。

圖2 液料比對杜仲葉中總多酚得率的影響Fig.2 The influence of liquid-to-solid ratio on the yield of total polyphenols

2.1.3 提取溫度對總多酚得率的影響 提取溫度對超聲波提取的影響如圖3所示，隨著溫度的升高，總多酚得率先升高而后急劇降低。這與總多酚的熱穩(wěn)定性有關(guān)，多酚類物質(zhì)含有大量酚羥基，化學(xué)性質(zhì)較為活潑，高溫會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定甚至降解，從而影響總多酚得率。因此總多酚的提取溫度控制在35℃左右較優(yōu)。

圖3 提取溫度對杜仲葉中總多酚得率的影響Fig.3 The influence of extraction temperature on the yield of total polyphenols

2.1.4 提取時間對總多酚得率的影響 液料比對超聲波提取的影響如圖4示，總多酚得率首先隨著提取時間的增加而增加，超過30min后，總多酚得率增長緩慢。這可能是因為總多酚的溶出需要一定的時間，適當(dāng)延長時間其得率會增加，當(dāng)總多酚得率達到最大值后，繼續(xù)延長時間，將會增加雜質(zhì)的溶出，同時增加提取成本，因此提取時間以30min較優(yōu)。

圖4 提取時間對杜仲葉中總多酚得率的影響Fig.4 The influence of extraction time on the yield of total polyphenols

2.1.5 提取次數(shù)對總多酚得率的選擇 提取次數(shù)對超聲波提取方法的影響如圖5所示，由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，總多酚的溶出率也隨之增加，2次提取的效果（4.583%）明顯高于1次（4.432%），繼續(xù)增加提取次數(shù)，還會有少量的多酚溶出（4.600%），但對其得率貢獻不大，之后總多酚得率變化趨于平緩（4.631%、4.642%），因此從總多酚得率及節(jié)約試劑的角度出發(fā)，選擇提取次數(shù)為2次，后續(xù)所有實驗固定提取次數(shù)為2次。

圖5 提取次數(shù)對杜仲葉中總多酚得率的影響Fig.5 The influence of extraction times on the yield of total polyphenols

2.2 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的統(tǒng)計設(shè)計原理，參考單因素實驗結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，選擇提取溶劑、液料比、提取溫度及提取時間四個因素，進行四因素三水平實驗設(shè)計，共29個實驗點，每個實驗點三次平行，實驗結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)面法回歸方程及方差分析 由Box-Benhnken設(shè)計擬合，得到響應(yīng)值Y對編碼自變量的二次多項回歸方程為：Y=4.30+0.29A+0.24B+0.16C+ 0.058D-0.15AB+0.066AC-0.13AD+0.039BC-3.9750E-003BD-0.18CD-0.75A2-0.078B2-0.013C2+1.767E-003D2。從該回歸方程可以看出，四個因素對響應(yīng)值的影響順序為：溶劑濃度（A）＞液料比（B）＞提取溫度（C）＞提取時間（D）。對該模型進行方差分析及顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

該回歸方程的F值為31.25，概率p＜0.0001，表明模型顯著；確定系數(shù)R2adj=0.9380，說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系顯著；變異系數(shù)c.v.=3.05%，說明該回歸方程精密度良好；失擬項F值為5.76，概率p=0.0531＞0.05，失擬項不顯著，表明該回歸方程在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該模型代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。由表3可知，對總多酚得率影響顯著的因素是A、B、C、AB、AD、CD、A2、C2，說明響應(yīng)值與因素之間不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有影響，且因素A與B、A與D、C與D對響應(yīng)值有較強的交互作用。

2.2.3 響應(yīng)曲面圖分析 根據(jù)二次多項回歸方程，建立各因素兩兩交互作用響應(yīng)曲面圖，如圖6～圖8所示。由圖6可以看出，液料比一定時，隨著提取溶劑濃度增大，總多酚得率逐漸增大，當(dāng)響應(yīng)值增加到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。溶劑濃度一定時，料液比對總多酚得率的影響較小。響應(yīng)面投影呈橢圓形，說明提取溶劑濃度與液料比的交互作用對總多酚得率影響較大，這與方差分析結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果Table 2 The experiment design and results of RSM

圖6 溶劑濃度與液料比對總多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for the effect of extraction solvent and liquid-to-solid ratio on the yield of total polyphenols

圖7與圖6變化趨勢基本一致，提取時間一定時，總多酚得率隨著提取溶劑濃度的增加而增加，達到極值后隨著提取溶劑濃度的增加而逐漸減少。溶劑濃度一定時，隨著提取時間的增加，總多酚得率基本保持不變，提取時間對總多酚得率的影響較小。響應(yīng)面投影也呈橢圓形，說明提取溶劑濃度與提取時間的交互作用對總多酚得率影響較大，與方差分析結(jié)果吻合。

圖7 溶劑濃度與提取時間對總多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for the effect of extraction solvent and time on the yield of total polyphenols

圖8 提取溫度與提取時間對總多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface for the effect of extraction temperature and time on the yield of total polyphenols

圖8中，在提取溫度取值較小時，響應(yīng)值隨提取時間的增加而增加，提取溫度取值較大時，響應(yīng)值與提取時間變化趨勢相反，而隨著提取溫度的增加，響應(yīng)面為一不對稱曲面且坡度較陡，說明提取溫度與提取時間之間交互作用明顯。當(dāng)提取溫度較低時，延長超聲波輔助提取的時間可以提高杜仲葉中總多酚的得率，而當(dāng)提取溫度較高時，總多酚溶出速度加快，但是為了避免熱敏性多酚類物質(zhì)因溫度過高而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)破壞，必須適當(dāng)縮短超聲波輔助提取時間。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

2.2.4 優(yōu)化與驗證實驗 對回歸方程求一階偏導(dǎo)并使其等于零，求解方程即可得到響應(yīng)值最大時各因素取值，即杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取的最佳工藝條件為：提取溶劑為54.41%的乙醇溶液，液料比為25∶1mL·g-1，提取溫度為45℃，提取25min，提取2次?？紤]到實際實驗的可操作性，將上述最優(yōu)參數(shù)調(diào)整如下：提取溶劑55%乙醇，液料比25∶1mL·g-1，45℃下提取25min，提取2次，并據(jù)此進行結(jié)果驗證，平行測定3次。杜仲葉中總多酚平均得率為4.678%± 0.0158%，與模型預(yù)測值（4.688%）的相對誤差為0.22%＜5%，在可允許范圍內(nèi)，且遠遠高于文獻報道中采用超聲法最優(yōu)工藝進行提取得到的杜仲葉中多酚得率（0.175%）[19]，說明經(jīng)模型推測得到的最佳工藝參數(shù)對實際實驗的預(yù)測較為可靠，具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過單因素實驗探索提取溶劑、液料比、提取溫度、提取時間及提取次數(shù)對杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取的影響，選取Box-Benhnken實驗的范圍和水平，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對各因素的最佳水平范圍及其交互作用進行了研究，建立了影響總多酚得率的二次多項回歸方程模型，得到杜仲葉中總多酚超聲波輔助提取最佳工藝條件為：55%乙醇，25∶1mL·g-1料液比，45℃下提取25min，提取兩次。在此條件下，杜仲葉中總多酚得率為4.678%，與模型預(yù)測值（4.688%）相差0.22%，工藝條件準確可靠，且該工藝生產(chǎn)周期短、能耗低，易于操作，可為后期杜仲葉綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction technology for total polyphenols in leaves of Eucommia ulmoides Olive using response surface methodology

ZHANG Lin-jie1，PENG Sheng1，ZHANG Chang-wei1，WANG Zhi-hong1，ZHOU Yun-lei1，PENG Mi-jun1，*，ZHANG Shui-han2
（1.Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering，Hunan Engineering Laboratory for Eucommia ulmoides Oliv.，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China；2.Key Laboratory of Research and Development of New Drug of Chinese Traditional Medicine，Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410013，China）

Response surface analysis methodology（RSM）was used to optimizing the ultrasonic assisted extraction technology of total polyphenols in leaves of Eucommia ulmoides Olive.The influence on the technology caused by the variety of extraction solvents and the concentrations，liquid-to-solid ratio，extraction time，extraction temperature and extraction times was investigated.Experiments were arranged according to Box-Behnken central composite experiment design based on results of single-factor experiments.Response surface analysis was applied to create the two multinomial mathematical and optimize the extract process. Results showed that the optimum parameters for extracting from leaves of Eucommia ulmoides Olive were 55% ethanol，25 times the amount of solvent and 25min at 45℃ twice.Under these condition，the yield of total polyphenols was 4.678%.

leaves of Eucommia ulmoides Olive；total polyphenols；ultrasonic assisted extraction；response surface method

Q351

B

1002-0306（2014）08-0228-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.043

2013－07－31 *通訊聯(lián)系人

張琳杰（1989-），女，碩士研究生，研究方向：林產(chǎn)資源化學(xué)。

國家“十二五”科技支撐計劃（2011BAI01B08）；湖南省科技廳項目（2012FJ4294）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助項目（湘教通（2010）212號；湖南省教育廳項目（11CY015）；吉首大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項目（JGY201226）。