卵白蛋白多肽的酶解制備及抗氧化活性研究

宋宏新，秦 婧，薛海燕，賀寶元

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西西安710021）

卵白蛋白多肽的酶解制備及抗氧化活性研究

宋宏新1，秦 婧1，薛海燕1，賀寶元2

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西西安710021）

以DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，采用堿性蛋白酶酶解卵白蛋白制備抗氧化活性肽，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量、溫度等因素對(duì)制備的影響。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，堿性蛋白酶的最佳水解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃，此條件下DPPH自由基清除率達(dá)到96.92%、水解度為57.14%。酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響最大，而底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度的影響最大。

卵白蛋白，堿性蛋白酶，抗氧化活性

卵白蛋白是蛋清中的最主要的蛋白質(zhì)，其含量占蛋清總蛋白質(zhì)的54%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高、加工與生物學(xué)性能良好，在免疫學(xué)研究和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及抗體制備中有重要作用[1-2]。卵白蛋白酶解后得到的多肽具有多種生理活性，如抗氧化肽、降壓肽、抗菌肽、免疫肽等。抗氧化肽不僅具有多肽產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)作用，且具備抗氧化和清除自由基的功能，幫助機(jī)體消除多余的自由基、增強(qiáng)人體抗衰老、抗疾病能力[3-4]。Davalos等研究發(fā)現(xiàn)，卵白蛋白酶解物具有強(qiáng)抗氧化活性分離出具較強(qiáng)抗氧化性的多肽Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu[5]。周國(guó)儀等純化雞卵清蛋白多肽，得到了兩組對(duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)的組分，清除率分別為84.02%和81.17%，分子量分別集中在180u左右200u左右[6]。沈勇根等用胃蛋白酶水解卵白蛋白得到了抗氧化能力較強(qiáng)的3個(gè)肽分別是源于雞蛋卵白蛋白第115～117氨基酸殘基（Pro-Glu-Tyr），分子質(zhì)量408.14u；第245～248氨基酸殘基（Leu-Pro-Asp-Glu），分子質(zhì)量473.19u；第148～150氨基酸殘基（Trp-Val-Glu），分子質(zhì)量433.18u[7]?？梢妬?lái)源于蛋清源的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，且安全性極高，因而在保健食品以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。

卵白蛋白分子不耐酶解，由385個(gè)氨基酸殘基組成，其中50%以上為疏水氨基酸，而堿性蛋白酶有水解疏水性氨基酸的專一性，主要裂解的疏水性氨基酸如：Leu、Ile、Val等。卵白蛋該酶水解位點(diǎn)相符合。故本研究采用堿性蛋白酶酶解卵白蛋白，對(duì)其酶解物的抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵白蛋白A5253（純度62%～88%） Sigma公司；堿性蛋白酶（酶活≥200000U/g） 北京奧博興生物技術(shù)有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH，分析純）Sigma公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等 均為分析純。

752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HC-3081型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳儀器有限公司；酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋（HH-1） 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿性蛋白酶水解方法 溶解卵白蛋白粉→用氫氧化鈉調(diào)pH至10→將樣品置于水浴鍋里，待樣品溫度升至酶解溫度時(shí)加酶→酶解一定時(shí)間→用鹽酸調(diào)pH至5滅酶→離心→取上清液待測(cè)。

1.2.1.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 固定時(shí)間5h、加酶量6500U/g、溫度55℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、4%、5%、6%，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.2 酶解時(shí)間 固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、加酶量6500U/g、溫度55℃，分別酶解3、4、5、6h，考察酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.3 加酶量 固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、時(shí)間5h、溫度55℃，加酶量4500、5500、6500、7500U/g，考察加酶量對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.1.4 酶解溫度 固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、時(shí)間5h、加酶量6500U/g，溫度45、55、65℃，考察酶解對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 抗氧化活性測(cè)定采用測(cè)定DPPH自由基清除率[8]。準(zhǔn)確稱取10mg DPPH溶于100mL無(wú)水乙醇得儲(chǔ)備液，冰箱避光保存。用時(shí)稀釋4倍得6.5×10-5mol/L DPPH·溶液，另將待測(cè)抗氧化劑配制成系列溶液。對(duì)照組：2.5mL的6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液+0.5mL蒸餾水；樣品：2.5mL的6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液+0.5mL樣液；空白組：2.5mL無(wú)水乙醇溶液+0.5mL樣液。各組反應(yīng)10min后1cm比色皿517nm下測(cè)定吸光值。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。然后按下式計(jì)算：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0為對(duì)照組吸光值；Ai為樣液吸光值；Aj為未加DPPH的空白組吸光值。

1.2.2.2 指標(biāo)的測(cè)定 水解度測(cè)定：水解度（%）=（氨基態(tài)氮/總氮）×100；

氨基氮測(cè)定：采用甲醛滴定法[9]。分別吸取10mL不同水解度的水解液于100mL燒杯中加蒸餾水60mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.050mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=8.20時(shí)停止攪拌，加入甲醛10mL（pH=9.20），用磁力攪拌器混勻，再用0.050mol/L NaOH滴定至pH=9.20，記下加入甲醛后消耗的0.050mol/L氫氧化鈉體積（mL），同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

式中：V：樣品耗用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)；V0：空白耗用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)；N：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度。

總氮測(cè)定：采用微量凱氏定氮法[10]。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 以DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量、溫度為考察因素，取三個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，確定堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的最佳工藝條件，并對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 各因素對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.1.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響 如圖1所示，DPPH自由基清除率、水解度隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而先升高后降低，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)兩者均達(dá)到最大分別為87.67%和72.45%。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～4%，兩者都迅速提高，這說(shuō)明底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，較低的底物量不足以與酶完全反應(yīng)，故增大底物質(zhì)量能夠加快酶催化反應(yīng)速率，所以增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)二者都急劇增加；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大超過(guò)4%時(shí)，二者都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，可能因酶的活性中心已被底物飽和，再增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，反應(yīng)速度也不再增加，而且還有一定程度的抑制作用。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)初步定為4%。

圖1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.1 Effect of ovalbumin concentration on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響 如圖2所示，DPPH自由基清除率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而先增大后減小，在酶解3～5h時(shí)，DPPH清除率顯著提高，并在5h達(dá)到最高為90.18%，后又下降。水解度則隨著時(shí)間延長(zhǎng)而一直上升，在6h達(dá)到最大為80.84%。在3～5h時(shí)，二者均提升顯著是因?yàn)槊概c底物充分結(jié)合反應(yīng)迅速；而5～6h時(shí)，酶與底物依然結(jié)合充分故水解度依然上升，但DPPH清除率下降可能是因?yàn)橐呀?jīng)形成的抗氧化肽已被部分氧化，從而引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化，致使DPPH清除率下降。綜合考慮選擇酶解時(shí)間5h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.2 Effect of contact time on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.3 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響如圖3所示。由圖3可見，DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加先上升后下降，在4500～6500U/g時(shí)，DPPH清除率顯著提升，并在6500U/g達(dá)到最高為85.33%。水解度隨著加酶量的增加呈上升趨勢(shì)，在7500U/g達(dá)到最大為73.46%。在4500～6500U/g時(shí)，二者均提升顯著是因?yàn)槊高M(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)首先要與底物形成一個(gè)中間物即酶-底物復(fù)合物，而這一步驟正是整個(gè)反應(yīng)的限速步驟，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^(guò)酶濃度時(shí)，這種中間物的生成速度取決于酶的濃度，所以此時(shí)增加酶的量，中間物生成速度加快，從而整個(gè)反應(yīng)的速度也加快；加酶量大于6500U/g后，水解度進(jìn)一步提升，而DPPH清除率下降，雖然水解度提高使得總多肽含量增加但水解出的具有抗氧化活性的多肽反而減少，說(shuō)明抗氧化活性與一定的肽結(jié)構(gòu)和分子量有關(guān)；再者，也有研究報(bào)道[11]，酶量過(guò)高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，也會(huì)阻礙酶對(duì)底物的水解。綜合考慮加酶量初步定為6500U/g。

圖3 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme content on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.1.4 溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響 眾所周知，在蛋白酶酶底物過(guò)程中有一個(gè)最適的反應(yīng)溫度，在一定范圍內(nèi)升高溫度，底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，表現(xiàn)在水解度上則呈增加趨勢(shì)[12]。如圖4所示，DPPH自由基清除率開始隨著溫度的升高先升高后下降，在55℃達(dá)到最高為85.81%，后又下降。水解度則隨著溫度的升高而升高，在65℃達(dá)到最高為72.81%。由于溫度升高，使得酶催化反應(yīng)速度加快，在相同時(shí)間內(nèi)的水解度提高，但DPPH清除率下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高影響了已經(jīng)生成的抗氧化肽的活性。綜合考慮選擇酶解溫度55℃。

圖4 溫度對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on DPPH radical scavenging and degree of hydrolysis

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得實(shí)驗(yàn)直觀分析表見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，影響卵白蛋白酶解物DPPH清除率的各因素先后順序?yàn)椋築＞D＞A＞C，即酶解時(shí)間＞酶解溫度＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞加酶量，最優(yōu)組合是A2B3C1D3，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得該條件下，DPPH自由基清除率達(dá)到96.92%、水解度為57.14%。

影響卵白蛋白酶解物水解度的因素先后順序?yàn)椋篈＞B＞C＞D，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解時(shí)間＞加酶量＞酶解溫度，最優(yōu)組合是A3B1C3D3，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解時(shí)間4h、加酶量7500U/g，溫度65℃。該組合未出現(xiàn)在正交表中，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得DPPH自由基清除率為68%、水解度達(dá)到95.77%。

由于卵白蛋白酶解物水解度主要與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，而DPPH自由基清除率則受酶解時(shí)間的影響最大，而以水解度為指標(biāo)的制備工藝優(yōu)化，并不能獲得高自由基清除率的最佳條件，因此在工藝控制中應(yīng)以抗氧化能力為衡量指標(biāo)。故選定最佳組合為A2B3C1D3，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃的酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見下表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the verification experiment

即最佳酶解工藝條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃。在此條件下，DPPH自由基清除率達(dá)到96.92%、水解度為57.14%。

3 結(jié)論

3.1 堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的抗氧化活性研究中，對(duì)DPPH自由基清除率的影響因素先后順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間＞酶解溫度＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞加酶量；對(duì)水解度的影響因素先后順序?yàn)椋旱孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解時(shí)間＞加酶量＞酶解溫度。

3.2 實(shí)驗(yàn)得出堿性蛋白酶水解卵白蛋白制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間6h、加酶量5500U/g，溫度65℃，此時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到96.92%、水解度為57.14%，可見堿性蛋白酶酶解卵白蛋白的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

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Study on preparation and antioxidant activity of peptides derived from ovalbumin

SONG Hong-xin1，QIN Jing1，XUE Hai-yan1，HE Bao-yuan2
（1.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China；2.College of Resource and Environment，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

In the experiment，ovalbumin was hydrolyzed by alkaline protease to obtain antioxidant peptide.Using DPPH radical scavenging activities and degree of hydrolysis as index，single factors including substrate concentration，enzymolysis time，enzyme concentration and enzymolysis temperature，were applied to research their influences on the preparation.Orthogonal experiment showed the most suitable condition of alkaline protease to hydrolyze ovalbumin was substrate concentration of 4%，enzymolysis time of 6h，alkaline protease of 5500U/g，enzymolysis temperature of 65℃ respectively.In this condition，DPPH radical scavenging rates reached 96.92%，and degree of hydrolysis was 57.14%.Enzymolysis time had the greatest influence on DPPH radical scavenging activities and substrate concentration had the greatest influence on degree of hydrolysis.

ovalbumin；alkaline protease；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.026

2013－08－17

宋宏新（1959-），男，碩士研究生，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301405）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012JM2009）；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)項(xiàng)目（2012JK0655）。