高效液相色譜法測定芡實中不同構(gòu)型維生素E的含量

王 紅，吳啟南，伍城穎，賀瀟瀟，吳達維，谷 巍，樂 巍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

高效液相色譜法測定芡實中不同構(gòu)型維生素E的含量

王 紅，吳啟南*，伍城穎，賀瀟瀟，吳達維，谷 巍，樂 巍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

目的：建立了芡實中不同構(gòu)型維生素E的RP-HPLC含量測定方法。方法：采用高效液相色譜分析，Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，5μm），以A相甲醇和B相水（97∶3）為流動相等度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測波長為295nm。結(jié)果：α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚均能夠達到基線分離，α-生育酚在0.12～1.2g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R21=0.9998；β+γ-生育酚在0.056～0.56g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R22=0.9999；δ-生育酚則在0.0096～0.096g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R23=0.9998。平均加樣回收率分別為100.47%，100.04%，99.10%；RSD分別為0.27%，4.65%，1.92%。安徽安慶芡實中總VE含量最高，可達2.2633mg/g。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為芡實藥材的質(zhì)量評價提供合理的參考依據(jù)。

芡實，高效液相色譜法，維生素E

芡實（Euryale Semen）為睡蓮科芡屬一年生水生草本植物芡（Euryale ferox Salisb.）的干燥成熟種仁，又名雞頭米、雞頭蓮，素有“水中人參”的美譽。為藥食兩用中藥，歷版藥典均有記載。其味甘、澀，性平，具有養(yǎng)血安神、益腎固精、補脾止瀉、祛濕止帶的功效[1]。營養(yǎng)價值較高，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸[2]、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、粗纖維等多種營養(yǎng)性成分[3]。但芡實的中醫(yī)功效物質(zhì)基礎(chǔ)始終未能明確。

維生素E又稱生育酚（tocopherol）或抗不育維生素，是一種脂溶性的維生素，金黃色或淡黃色粘稠油狀物，易溶于脂肪和乙醇等有機溶劑，不溶于水，對熱、酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定，對氧敏感。在醫(yī)藥領(lǐng)域，作為細胞內(nèi)的抗氧化劑，在促進性激素分泌、增強免疫功能、保護紅細胞、對抗自由基氧化、抑制誘變劑的形成、修復(fù)生物膜和DNA等中扮演著重要的角色，臨床上可用于治療老年性癡呆病、高血壓、冠心病、心肌梗塞、動脈硬化、血栓、不孕癥等[4]，是人體不可或缺的維生素之一，也是芡實的中醫(yī)功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此，開展芡實中維生素E的含量測定研究，對芡實質(zhì)量評價，提升藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均具有十分重要的意義。

維生素E，包括生育酚和三烯生育酚兩類共8種化合物，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚，其中α-生育酚是自然界分布最為廣泛含量最為豐富活性最高的維生素E形式，β、γ、δ-生育酚的活性分別是α-生育酚的50%、10%和3%，α-三烯生育酚約為30%，而其他三烯酚約為10%左右[5]。無論在營養(yǎng)、生理活性還是在安全性上天然維生素E均優(yōu)于合成的維生素E。

以下是α、β、γ、δ-生育酚同族異構(gòu)體。化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

圖1 維生素E結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of Vitamin E

關(guān)于芡實中維生素E含量測定國內(nèi)外還未有報道，本實驗擬通過改進樣品制備方法，采用高效液相色譜技術(shù)，建立芡實中不同構(gòu)型維生素E含量的測定方法，為芡實的質(zhì)量評價和綜合利用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡實 來源于全國15個產(chǎn)地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb的干燥成熟種仁，具體產(chǎn)地見表1；維生素E標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇 色譜純，江蘇漢邦科技有限公司，批號：131583；無水乙醇 分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：130512；石油醚 分析純，無錫市亞盛化工有限公司，批號：130107；氫氧化鉀 分析純，阿拉丁試劑有限公司，批號：131058；抗壞血酸 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20100108；無水硫酸鈉 分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：120511；自制超純水。

Waters 2695型高效液相色譜儀（高精度四元梯度泵、自動進樣器），Waters 2998 PDA檢測器，Empower色譜工作站，Waters XBridge C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm） Waters；KH300SP型超聲波提取設(shè)備（配有25KHz、40KHz雙頻，功率300W） 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；B-490 BUCHI Rotavapor R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；BT125型電子天平塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；SAGA-10TY型實驗室級超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液制備 精密稱取樣品約2g，過80目篩，置于100mL具塞錐形瓶中，依次加入60mL的無水乙醇，10mL抗壞血酸，超聲提?。l率25kHz，功率240W）[7]，提取3次，1h/次，合并提取液，過濾入球形蒸發(fā)瓶，用50mL無水乙醇分3次沖洗錐形瓶及殘渣，并入球形蒸發(fā)瓶，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑至干，用色譜甲醇溶解并定容至10mL，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）過濾，即得。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動相為V（甲醇）∶V（水）=97∶3，檢測波長295nm。柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：10μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取12、5.6、0.96mg的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品（因β-生育酚和γ-生育酚在此色譜條件較難分離，故使用β-生育酚代替γ生育酚的定量，測定兩者的總含量）[6]，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚濃度分別為1.2、0.56、0.096mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液。

表1 芡實樣品來源Table 1 Sources of euryales semen

1.3 數(shù)據(jù)的分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計算不同產(chǎn)地芡實的維生素E含量，采用平均距離法進行聚類分析，對不同產(chǎn)地芡實中的α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚及總維生素E含量進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

因α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚在295nm處有最大吸收峰，流動相為甲醇和水（97∶3），流速為1mL/min時能夠快速有效地分離α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚，其保留時間分別為6.827、8.033、9.204min，具體分析圖譜見圖3。樣品中，各目標(biāo)峰與其他雜質(zhì)峰分離良好。

2.2 維生素E提取優(yōu)化

國標(biāo)法[8]中VE的含量測定方法為HPLC法，但樣品的前處理方法回流皂化法操作較為繁瑣。實驗根據(jù)樣品中脂溶性成分含量較少的特點，分別考察了回流、索氏、超聲3種提取方法，石油醚、無水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮6種提取溶劑對VE含量測定的影響（見圖2），結(jié)果表明無水乙醇超聲提取效率高、省時、方便、快捷。

在此基礎(chǔ)之上，對超聲功率、提取時間、提取次數(shù)、粉碎粒度進行優(yōu)化，結(jié)果表明在超聲功率240W、提取時間為1h，提取次數(shù)3次、粉碎粒度為80目的情況下，VE提取較為完全。具體結(jié)果見圖2。

2.3 線性關(guān)系的考察實驗

分別精密吸取上述α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品母液100、200、500、800μL至1mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，進樣10μL，以色譜峰面積（Y）對濃度（X）進行回歸，得α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚的線性回歸方程見表2。

表2 線性方程及參數(shù)Table 2 Linear equations and parameters

圖2 維生素E提取優(yōu)化Fig.2 Optimization of extraction of vitamin E

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 精密吸取α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10μL，按1.2.2項所述色譜條件下重復(fù)進樣6次，測得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的峰面積RSD分別為1.69%、2.42%、2.79%，表明儀器進樣精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實驗 取1.2.1供試品溶液10μL，按1.2.2項所述色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12、16、24h進樣，測定α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚的峰面積的RSD分別為2.23%、2.97%、1.84%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重現(xiàn)性實驗 取同一產(chǎn)地芡實樣品，按1.2.1供試品制備方法配制6份，在1.2.2項所述色譜條件下，分別進樣10μL，測定α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚含量的RSD分別為1.38%、0.92%、3.61%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.4 加回收率實驗 精密稱取已知維生素E含量的樣品9份，分為3組，分別依次加入α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品1.0094、0.5231、0.1820mg，按1.2.1供試品制備方法制備樣品溶液，進樣10μL，進行測定，按下式計算回收率：回收率（%）=（測定VE量-樣品原VE量）/添加VE量×100，結(jié)果見表3。

2.5 樣品含量測定

按1.2.1供試品制備方法，制成不同產(chǎn)地樣品溶液10mL，平行進樣3次，每次10μL，測定峰面積，由線性方程計算得VE含量見表4，標(biāo)準(zhǔn)品及供試品色譜圖見圖3。

表3 回收率實驗結(jié)果（n=3）Table 3 Recovery results（n=3）

表4 不同產(chǎn)地芡實中不同構(gòu)型VE含量測定結(jié)果Table 4 Result of determination of different configuration of vitamin E from 15 habitats

2.6 維E含量聚類分析

以α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚及總維生素E含量測定結(jié)果為聚類分析，采用平均距離法進行聚類分析，得到聚類樹狀圖，如圖4所示。

圖3 VE標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of vitamin E from standard and sample

圖4 不同產(chǎn)地芡實維生素E含量測定結(jié)果聚類樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram based on determination of vitamin E from 15 habits

由圖4可知，按照維生素E含量的高低，15個產(chǎn)地芡實樣品可以分為3大類。其中3、11、6、10共4份樣品聚為一類，代表維生素E含量最高組，均分布于我國的華東及中南地區(qū)；1、2、4、5、8、9、13、14共8份樣品聚為一類，代表維生素E含量較高組，均分布于我國的西南及華東地區(qū)；7、12、15共3份樣品聚為一類，代表維生素E的含量較低組，由此可以看出，不同產(chǎn)地芡實中維生素E含量差別較大。

3 結(jié)論

本研究中維生素E含量測定結(jié)果顯示，除山東棗莊中的δ-生育酚含量較β+γ-生育酚含量高以外，其他各產(chǎn)地芡實中VE含量均符合α-生育酚＞β+γ-生育酚＞δ-生育酚的規(guī)律?？俈E含量，以S10（安徽安慶）含量最高（2.2633mg/g），S15（揚州寶應(yīng)）含量最低（1.3148mg/g）；α-生育酚含量，以安徽安慶含量最高（1.6889mg/g），揚州寶應(yīng)含量最低（0.7079mg/g）；β+ γ-生育酚含量，以四川成都含量最高（0.6572mg/g），S12（廣西桂林）含量最低（0.3133mg/g）；δ-生育酚含量，以S9（山東棗莊）含量最高（0.3745mg/g），廣西桂林含量最低（0.1146mg/g）。本文為臨床芡實的使用提供了合理的依據(jù)。

[1]陳藝林，周邦楷.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1982：133-146.

[2]陳蓉，吳啟南，沈蓓.不同產(chǎn)地芡實氨基酸組成分析與營養(yǎng)價值評價[J].食品科學(xué)，2011，32（15）：239-244.

[3]張汆，張國權(quán)，鄭建梅.安徽芡實營養(yǎng)特性分析[J].中國食品添加劑，2009（2）：206-209.

[4]崔鳳杰，王宏媛，陳志蔚，等.從脫臭餾出物提取天然生育酚研究進展[J].糧食與油脂，2012（7）：9-11.

[5]歐陽青，蔡文啟.天然維生素E的生物合成途徑[J].植物生理學(xué)通訊，2003，39（5）：501-507.

[6]陳祎清，莫文蓮.高效液相色譜測定玉米油生育酚含量研究[J].糧食與油脂，2010（9）：32-34.

[7]寇立娟，李蘭曉，王明林.反相高效液相色譜法快速測定植物油中的維生素E[J].中國食物與營養(yǎng)，2006（12）：42-43.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 12388-1990食品中維生素A和維生素E的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：591-592.

Determination of different configuration of vitamin E in Euryale Semen by HPLC

WANG Hong，WU Qi-nan*，WU Cheng-ying，HE Xiao-xiao，WU Da-Wei，GU Wei，YUE Wei
（College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Objective：A reversed-phase high performance liquid chromatographic method（RP-HPLC）was developed for determination of different configuration of vitamin E in Euryale Semen.Methods：RP-HPLC determination was performed on a Waters Xbridge C18column（4.6mm×150mm，5μm），Methanol-water（97∶3）was used as the mobile phase at the flow rate of 1.00mL/min，the column temperature was kept as 30℃ and the detection wavelength was set as 295nm.Results：α-tocopherol，β+γ-tocopherol，δ-tocopherol were separated in baseline，the linear range was 0.12～1.2g/L for α-tocopherol，0.056～0.56g/L for β+γ-tocopherol and 0.0096～0.096g/L for δ-tocopherol.R2were 0.9998，0.9999，0.9998，the average recoveries were 100.47%，100.04%，99.10%.RSD were 0.27%，4.65%，1.92%.The total Vitamin E content of the sample of Anhui was the highest with 2.2633mg/g.Conclusion：This method was sample，accurate and with good reproducibility，which could be used as Euryale Semen quality control of medicine and also provides a scientific reference for the rational use of Euryale Semen.

Euryale Semen；HPLC；vitamin E

TS207.3

A

1002-0306（2014）08-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.007

2013－09－13 *通訊聯(lián)系人

王紅（1989-），女，碩士研究生，研究方向：中藥品質(zhì)評價。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAI04B06）；江蘇省優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊“中藥資源化學(xué)”（2011）。