斑點雜交法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的臨床研究

李宇寧，徐冉行，劉東海

斑點雜交法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的臨床研究

李宇寧，徐冉行，劉東海

目的探討斑點雜交技術(shù)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的應(yīng)用價值。方法設(shè)計mecA基因特異性引物，用地高辛標(biāo)記；制備mecA基因探針，運用斑點雜交方法、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測mecA基因。結(jié)果100例臨床分離的金黃色葡萄球菌中共檢出mecA基因陽性32例，陽性率為32%；PCR方法檢出陽性36例，陽性率為36%。結(jié)論通過斑點雜交技術(shù)可以方便、特異地檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因。

微生物敏感性試驗；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；斑點雜交；mecA基因

近年來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的感染率不斷呈上升趨勢，MRSA的耐藥機制較復(fù)雜，目前認(rèn)為的機制主要有：染色體介導(dǎo)的固有耐藥、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移獲得性耐藥及基因表達(dá)調(diào)控異常性耐藥等。mecA基因是MRSA特有的耐藥基因，在MRSA耐藥機制中起到?jīng)Q定性的作用，該基因編碼耐藥菌特異的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a），從而造成細(xì)菌耐藥。本文進(jìn)行了地高辛標(biāo)記mecA基因探針的研究，并與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法比較，評價其對mecA基因直接檢測的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料100例金黃色葡萄球菌菌株均分離自寧波市第六醫(yī)院2010年5月至2012年7月住院患者的臨床標(biāo)本。所有菌株經(jīng)常規(guī)生化鑒定，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。引物合成mecA基因的PCR引物參照參考文獻(xiàn)設(shè)計[1]，上游引物為：5'-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3'，下游引物為：5'-CCAATTCCACATTGTITCGGTCTAA-3'，由上海英俊公司合成。

1.2 主要試劑和儀器地高辛隨機引物標(biāo)記探針試劑、雜交液及尼龍膜等購自Roche公司，PCR試劑及測序由上海生工生物工程有限公司提供，細(xì)菌鑒定儀為生物梅里埃ATB Expression，PCR擴增儀為中山達(dá)安DA7600。

1.3 方法

1.3.1 地高辛（DIG）隨機引物法標(biāo)記CGI-100基因探針提取用質(zhì)控菌株ATCC29213的DNA樣品，用該DNA作為模板，用mecA特異性引物擴增mecA片段，PCR總體積為25 l，其中10×PCR Buffer 2.5l，10 m mol/L dNTP mixture 2.0 l，TaKaRa LA Taq酶0.16 l，上下游引物各1 l，25 mmol/L MgCl22.0 l，模板DNA 1.5 l無菌水補足至25 l。擴增條件為：94℃2min，94℃30s，50℃30 s，72℃50 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。取20 l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒回收純化，用分光光度計測定CGI-100基因的濃度和純度，取CGI-100基因DNA0.8 g，無菌水補充至16 l，在沸水中變性10min，加入DIG隨機引物法標(biāo)記試劑（Roche公司），在37℃標(biāo)記12 h。

1.3.2 標(biāo)記探針效率的檢測嚴(yán)格按照Roche公司提供的說明進(jìn)行，將對照DNA與待檢測的DNA點在尼龍膜上，免疫顯色后對比分析探針標(biāo)記效率。將標(biāo)記好的探針放置―20℃保存。

1.3.3 金黃色葡萄球菌標(biāo)本DNA樣品的提取各樣本細(xì)菌DNA的提取參照文獻(xiàn)報道進(jìn)行[2]，在血平板上生長的金黃色葡萄球挑取菌落，放入無菌0.9%氯化鈉注射液中，離心棄去上清液，沉淀中加入蛋白酶K裂解液與溶葡萄球菌素，混勻，37℃孵育30 min，離心取上清即為DNA。

1.3.4 PCR法檢測各標(biāo)本中mecA基因片段PCR體系與反應(yīng)條件同上1.3.1步驟，最后取5.0 l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳（170 V，20 min）鑒定。

1.3.5 斑點雜交用分光光度計測定各標(biāo)本DNA的濃度和純度，利用點樣器依次點在尼龍膜上，每個樣本2.0 g，固定、雜交、免疫顯色均按說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用2檢驗。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測mecA結(jié)果在100例金黃色葡萄球菌中，共檢出mecA基因陽性36例，陽性率為36%。見封四彩圖4。

2.2 斑點雜交法檢測mecA結(jié)果共檢測出mecA基因陽性32例，陽性率為32%，與PCR檢出陽性率比較，采用斑點雜交檢出的32例陽性標(biāo)本，PCR法檢測出31例陽性，有1例為陰性，在瓊脂糖凝膠電泳上觀察到此例的PCR電泳條帶模糊且位置不符合故被認(rèn)為是非特異性擴增產(chǎn)物，后經(jīng)DNA測序證實是mecA陽性標(biāo)本，而PCR法另外5例陽性標(biāo)本，采用斑點雜交法為陰性結(jié)果。見封四彩圖5。

2.3 陽性率統(tǒng)計對100例金黃色葡萄球菌mecA基因進(jìn)行檢測，斑點雜交法共檢出32例陽性，PCR方法共檢出36例陽性，兩種方法陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（2=0.36，＞0.05）。

3 討論

自1961年英國首次報道MRSA以來，其感染率逐年上升，在我國關(guān)于MRSA相關(guān)的報道也很多[3-4]。研究表明：金葡菌對-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制主要有兩種，其一是金葡菌可產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，其二是該菌可以產(chǎn)生過量的青霉素結(jié)合蛋白（PBPS）。以上兩種耐藥現(xiàn)象可以提高抗生素的藥物劑量而解除[5]。MRSA是院內(nèi)感染的重要病原菌，主要耐藥機制是mecA基因編碼低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a）所致。在-內(nèi)酰胺類抗生素存在的情況下，當(dāng)其他的PBP被抑制而不能發(fā)揮正常生理效應(yīng)時，PBP2a可代替被抑制的PBP發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)菌生存而耐藥[6]。

國外已將mecA基因測定作為MRSA的確診實驗，因此檢測mecA基因的存在與否可作為MRSA感染觀察的一種分子標(biāo)志物[7]。目前，苯唑西林紙片擴散法是美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的鑒定MRSA的常用方法，但該法影響因素較多，準(zhǔn)確性較差[7]。利用地高辛標(biāo)記基因探針檢測基因的文獻(xiàn)報道較多[8-9]。本研究采用地高辛標(biāo)記部分mecA基因序列，制備了用于檢測mecA基因的DNA探針，經(jīng)對照鑒定其檢測靈敏度為0.1 pg，完全符合雜交實驗要求。對100例金葡菌mecA基因檢測可知：斑點雜交法與PCR法兩者的陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異。而5例PCR法為陽性，斑點雜交法為陰性的標(biāo)本，經(jīng)DNA測序確為mecA陰性標(biāo)本，說明PCR法存在一定的假陽性率。因斑點雜交采用了特異性DNA探針，故斑點雜交和PCR方法相比較，其特異性前者高，靈敏度后者較高。

綜上所述，雖然PCR技術(shù)被認(rèn)為是檢測mecA的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但當(dāng)PCR產(chǎn)物條帶不能確定是特異性帶還是非特異性帶時，斑點雜交有助于特異性鑒定，由于雜交技術(shù)是以核酸堿基嚴(yán)格配對為前提的，因此斑點雜交還可以初步篩選待檢基因的突變情況，對了解細(xì)菌的耐藥機制有一定意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.12.068

R446.5

A

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