骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程材料的研究進(jìn)展

王穎楠，趙敏，徐惠成

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程材料的研究進(jìn)展

王穎楠，趙敏，徐惠成

1 簡(jiǎn)述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）

1.1 BMSCs概念及其特點(diǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類(lèi)來(lái)源于中胚層的具有自我更新及多向分化潛能的干細(xì)胞，廣泛分布于骨髓、臍血、外周血、胎盤(pán)、胎肝、胎腎、胎肺、軟骨膜、骨膜、脂肪及肌肉等組織中。BMSCs具有長(zhǎng)的突觸，最易獲取，因此是目前用于MSCs研究的主要來(lái)源。MSCs在特定的條件下可以誘導(dǎo)分化為跨系，甚至跨胚層的組織細(xì)胞，成為現(xiàn)代組織工程學(xué)中理想的種子細(xì)胞；同時(shí)，MSCs易于導(dǎo)入外源目的基因，易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，因此也成為基因治療的首選細(xì)胞[1]。

1.2 BMSCs的體外分離和培養(yǎng)目前分離純化BMSCs的方法主要有4種：（1）貼壁篩選法；（2）密度梯度離心法；（3）免疫磁珠分離法，但后2種分離法價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜，其應(yīng)用受到了限制；（4）流式細(xì)胞儀分選法。二維培養(yǎng)技術(shù)已普遍采用，盡管逐步得到改善，但仍存在難以克服的缺點(diǎn)：（1）貼壁的表面積有限，細(xì)胞產(chǎn)量低；（2）無(wú)菌操作過(guò)程繁瑣，容易污染；（3）代謝產(chǎn)物逐漸堆積，排除不及時(shí)易引起細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至退化；（4）細(xì)胞離開(kāi)了體內(nèi)同細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu)，生物學(xué)行為受到影響，容易變異。因此，有人提出三維培養(yǎng)的設(shè)想。1998年，Qiu等[2]對(duì)鼠骨髓基質(zhì)進(jìn)行三維培養(yǎng)。Glowacki等[3]用膠原海綿作為載體進(jìn)行三維灌注培養(yǎng)，減少了代謝產(chǎn)物的聚集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)含量提高，所培養(yǎng)的細(xì)胞活性和功能均加強(qiáng)。大載體生物反應(yīng)器已成功用于某些植物和動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)，能否將其用于BMSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)，并形成產(chǎn)業(yè)化，從而滿足細(xì)胞工程和基因工程對(duì)種子細(xì)胞量的需求，還有待于一些問(wèn)題的順利解決。

2 簡(jiǎn)述脫細(xì)胞基質(zhì)（ECM）

2.1 ECM的特點(diǎn)ECM是應(yīng)用物理或

化學(xué)方法將異體或異種組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，從而去除組織移植過(guò)程中引起排斥反應(yīng)的相關(guān)抗原，以用于修復(fù)損傷組織的一種新型生物材料。ECM在生物補(bǔ)片材料領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。ECM在組織學(xué)方面，它較好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分和結(jié)構(gòu)，為其植入體內(nèi)修復(fù)缺損組織提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從豬小腸（SIS）制備的具有顯著的組織來(lái)源特性，經(jīng)常作為ECM支架的原型參照物。在凍干狀態(tài)下，SIS含有90%的膠原，其中最主要的是I型膠原蛋白，并含有少量的III、IV、V和VI型膠原成分。豬膀胱制備的脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)（UBM）和SIS含有的膠原類(lèi)型相同，但I(xiàn)II型膠原含量稍多一些，并且UBM含有基底層特殊成分：VII型膠原，該型膠原是UBM區(qū)別于其他ECM的顯著特點(diǎn)[4]。在免疫學(xué)角度，它清除了具有強(qiáng)抗原性的各種細(xì)胞，所以組織抗原性明顯降低[5]。同時(shí)它具有良好的組織相容性這一生物學(xué)特點(diǎn)。不同組織來(lái)源的ECM顯然具有不同的特性。

目前ECM的應(yīng)用方式有以下三種：（1）直接替代；（2）做為組織工程的支架材料；（3）埋植充填。ECM作為支架材料近年來(lái)發(fā)展迅猛，展示出強(qiáng)大的生命力及臨床應(yīng)用前景。并且已有應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的報(bào)道。

2.2 ECM的制備方法含水的組織薄片可以直接用于支架材料；數(shù)個(gè)含水的組織薄片可以經(jīng)真空壓縮成一個(gè)多層的支架材料；含水的組織薄片也可以冷凍；凍干的薄片可以經(jīng)粉碎制成微粒形式的材料；這種經(jīng)粉碎的材料可以經(jīng)胰酶消化制成液態(tài)的材料，可以再聚合成凝膠或者可以與合成聚合物聚合成一種混合的支架[6]。但常用的為酶消化法、滲透溶液法和去垢劑清洗法。去垢劑多采用聚氧乙烯辛基苯基醚（Triton-x100），胰酶多采用乙二胺四乙酸（EDTA）。

3 BMSCs與ECM構(gòu)建組織工程材料

3.1 BMSCs與ECM構(gòu)建組織工程材料的可能性組織工程學(xué)是近年來(lái)新興起的一門(mén)學(xué)科，受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。其核心是利用組織工程學(xué)技術(shù)與生命科學(xué)的成果，將活細(xì)胞與生物材料結(jié)合，修復(fù)、重建、維持、恢復(fù)或提高人體組織的功能[7]。理想支架材料應(yīng)具備以下要求：（1）有良好的組織相容性；（2）生物可降解性；（3）無(wú)免疫原性；（4）多孔性和高空隙率，利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)組織再生；（5）可塑性；（6）有一定機(jī)械強(qiáng)度[8]。ECM作為一種天然細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，幾乎具備以上各種生物特性，ECM是種子細(xì)胞及再生相關(guān)分子復(fù)合良好支架，保留了細(xì)胞外基質(zhì)的生理結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的種植提供了良好的三維空間結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)環(huán)境。種子細(xì)胞可以進(jìn)入脫細(xì)胞后，與ECM成分相互作用，產(chǎn)生新生組織。植入體內(nèi)后，干細(xì)胞能在體內(nèi)分化、增值，理論上能豐富組織細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，解決組織修復(fù)不足的矛盾，提高遠(yuǎn)期效果。因此作為種子細(xì)胞的BMSCs與ECM構(gòu)建是較理想的組織工程材料，具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 BMSCs與ECM構(gòu)建組織材料的特性

3.2.1 生物相容性生物相容性是基質(zhì)材料在應(yīng)用前首先要解決的問(wèn)題。細(xì)胞與材料的黏附是體外構(gòu)建組織工程的前提和基礎(chǔ)，細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ?，才能進(jìn)行遷移、增殖、分化及生物學(xué)活性的表達(dá)。Zheng等[9]通過(guò)體內(nèi)植入法證實(shí)脫鈣骨基質(zhì)與BMSCs具有良好的生物相容性，且具有體內(nèi)成骨及成軟骨能力。Wang等[10]將BMSCs與完全脫鈣骨基質(zhì)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成纖維軟骨組織，結(jié)果顯示完全ECM為多孔結(jié)構(gòu)，孔隙較高，可提供寬大的內(nèi)表面和空間，利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞良好地黏附于支架上，顯示出良好的生物相容性。

3.2.2 誘導(dǎo)活性Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，脫鈣骨基質(zhì)具有良好的軟骨誘導(dǎo)活性，軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)后基質(zhì)中有較多Ⅱ型膠原表達(dá)。Mauney等[12]發(fā)現(xiàn)三維的部分脫鈣骨較其他合成材料具有更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性以及促進(jìn)人的骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞分化的能力。

3.2.3 ECM的生物力學(xué)特性膠原纖維的構(gòu)型因素對(duì)ECM支架的生物力學(xué)性能的影響非常關(guān)鍵，其排列和組合方式是由原組織器官的功能所需決定的。Sun等[13]制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)在力學(xué)性質(zhì)方面，較新鮮未脫細(xì)胞骨基質(zhì)稍減弱，但兩組在彈性載荷、破壞載荷、彈性模量方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明脫細(xì)胞過(guò)程對(duì)骨松質(zhì)力學(xué)性質(zhì)無(wú)明顯影響。也有以新鮮豬肋骨為原料制備脫細(xì)胞骨基質(zhì)，該材料的載荷-變形曲線顯示，得出材料的彈性模量顯著增加，但其壓縮破壞負(fù)荷、破壞極限、壓縮極限及極限比率等均有減少和降低，但與新鮮骨組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也有用NaOH消蝕法制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，進(jìn)行抗張力試驗(yàn)，將ECM片與Marlex網(wǎng)（來(lái)自美國(guó)巴德公司）裁剪成2 cm×3cm大小的平片，置于夾持器上，以50 mm/min拉伸，記錄拉至補(bǔ)片完全斷裂時(shí)所用的力。將單獨(dú)ECM片與Marlex網(wǎng)行抗張力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Marlex網(wǎng)的抗張力高于ECM。但植入體內(nèi)5周后，ECM筋膜組織的抗張力高于Marlex筋膜組織。與文獻(xiàn)[14]報(bào)道相似。當(dāng)對(duì)SIS進(jìn)行雙軸力學(xué)性能測(cè)試的時(shí)候，其纖維排列方式使SIS顯示各向異性的力學(xué)特點(diǎn)，在纖維縱軸方向上具有很好的張力和切向力。加上外力后，ECM內(nèi)的纖維排列會(huì)發(fā)生變化，不僅是膠原纖維從典型的彎曲狀態(tài)變成直線狀，而且纖維還可以向張力方向發(fā)生扭轉(zhuǎn)，只要在支架可承受的范圍內(nèi)，這種扭轉(zhuǎn)是可以回復(fù)的，而且可以通過(guò)簡(jiǎn)單的仿射模型對(duì)支架膠原排列變化進(jìn)行預(yù)測(cè)。但是過(guò)強(qiáng)且不對(duì)稱(chēng)的張力會(huì)造成扭轉(zhuǎn)的不可回復(fù)，從而造成支架的整個(gè)生物力學(xué)特性的改變。

3.2.4 ECM植入體內(nèi)后的力學(xué)性能變化植入體內(nèi)后，ECM的機(jī)械性能會(huì)發(fā)生變化[15]，這種變化和材料降解率、植入部位組織微環(huán)境和機(jī)械微環(huán)境關(guān)系密切，另外還和新生細(xì)胞種植并生成新細(xì)胞外基質(zhì)的速度和范圍相關(guān)。一些研究表明：植入后短期內(nèi)，由于ECM在體內(nèi)的快速降解，會(huì)導(dǎo)致承受張力能力下降，這在大鼠膀胱和肌腱的替代實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行ECM的體內(nèi)降解定量測(cè)定，均得出了類(lèi)似結(jié)果。降解同時(shí)發(fā)現(xiàn)新生組織的替代，在重建的早期，降解較快，但新生的ECM組織卻未能完全替代，因此導(dǎo)致最

初的力學(xué)性能下降。但是，一旦遷入的細(xì)胞定植后開(kāi)始在ECM上擴(kuò)增，則產(chǎn)生快速的ECM支架重構(gòu)，從而支架強(qiáng)度和力學(xué)性能重新獲得改善[16]。

4 盆底重建中的應(yīng)用

盆底重建外科是一個(gè)新的亞學(xué)科，旨在研究由于盆底支持結(jié)構(gòu)損傷、缺陷及功能障礙所致疾患的診斷與處理，其研究的主要問(wèn)題是女性壓力性尿失禁（SUI）和盆腔器官膨出（POP）。

目前認(rèn)為各種利用補(bǔ)片的術(shù)式是治療POP的最佳手段，臨床廣泛使用的聚丙烯合成材料的補(bǔ)片雖然療效確切的優(yōu)點(diǎn)，但具有順應(yīng)性差、組織侵蝕性強(qiáng)及感染率高等缺點(diǎn)，并導(dǎo)致性交痛等相關(guān)并發(fā)癥。而選擇經(jīng)過(guò)ECM是克服上述固有缺陷的方法之一。ECM材料植入人體后最終會(huì)降解，通過(guò)致膠原組織增生、周?chē)M織移行而形成支撐結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到支撐盆底的作用。相對(duì)于傳統(tǒng)的聚丙烯補(bǔ)片，其優(yōu)點(diǎn)是組織侵蝕率低，術(shù)后性交痛、盆腔慢性疼痛及小便困難的發(fā)生率低，其順應(yīng)性也相對(duì)較好。因此ECM補(bǔ)片有可能成為未來(lái)最有希望的盆底補(bǔ)片。

作為理想的盆底補(bǔ)片材料和理想的盆底組織工程支架，其標(biāo)準(zhǔn)其實(shí)并無(wú)差異：要求安全、相對(duì)持久、有一定抗菌性以適應(yīng)盆底特殊環(huán)境；其次要有好的組織相容性，可降解的同時(shí)，能夠做到有效的盆底組織替代，而非瘢痕增生；另外，盆底為腹腔最低處，要求材料具有一定的強(qiáng)度能經(jīng)受腹壓增加時(shí)的張力，而且還要有一定的順應(yīng)性，能緩解腹壓增加的力學(xué)傳導(dǎo)。

如果能在ECM材料上選擇干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，構(gòu)建組織工程補(bǔ)片應(yīng)該是解決組織修復(fù)不足的關(guān)鍵，組織工程補(bǔ)片植入體內(nèi)后，無(wú)異物排斥反應(yīng)，具備良好的順應(yīng)性，補(bǔ)充盆底組織，增加盆底強(qiáng)度，從而達(dá)到支撐盆底的作用，與當(dāng)前的合成材料補(bǔ)片相比，具有顯著優(yōu)點(diǎn)。在ECM上種植具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，該細(xì)胞不僅能進(jìn)一步提高ECM的順應(yīng)性，還能在體內(nèi)分化，增殖，從而豐富盆底細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，解決組織修復(fù)不足的矛盾，提高遠(yuǎn)期效果。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.080

R551.3

C

1671-0800(2014)08-1054-03

315040寧波，解放軍第113醫(yī)院（王穎楠、趙敏）；第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院（徐惠成）

徐惠成，Email:hanluowynan@foxmail.com