HO－1對(duì)銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞TNF－α和IL－10生成的影響

馬良娟宋 穎姚軍英柏冰雪?

HO－1對(duì)銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞TNF－α和IL－10生成的影響

馬良娟1宋 穎2姚軍英1柏冰雪1?

目的: 確定血紅素氧合酶同工酶1(HO－1)對(duì)銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)TNF－α和IL－10分泌的影響。方法: 分離培養(yǎng)PBMC,應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)PBMC中HO－1的表達(dá),用ELISA法檢測(cè)上清中TNF－α和IL－10水平。結(jié)果: CoPP(HO－1特異性誘導(dǎo)劑－鈷原卟啉)可誘導(dǎo)健康者和銀屑病患者PBMC表達(dá)HO－1蛋白,表達(dá)量隨CoPP濃度的增加而增加。4種不同濃度CoPP所誘導(dǎo)的HO－1均可抑制TNF－α的分泌和增強(qiáng)IL－10的分泌,其抑制和增強(qiáng)作用均在CoPP 10μmol/L濃度下達(dá)高峰。結(jié)論: HO－1可調(diào)節(jié)銀屑病患者PBMC TNF－α和IL－10的分泌,從而可能對(duì)銀屑病起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

銀屑??； 血紅素氧合酶－1； 外周血單一核細(xì)胞； 腫瘤壞死因子α； 白細(xì)胞介素10

銀屑病是一種常見的慢性自身免疫性皮膚病,炎癥細(xì)胞因子如TNF－α,IL－10等與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展有密切的關(guān)系。血紅素氧合酶(HO)－1是催化血紅素氧化降解過程中的關(guān)鍵酶,研究表明HO－1具有細(xì)胞保護(hù)、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗增殖和免疫抑制的作用。我們前期通過在銀屑病動(dòng)物模型中誘導(dǎo)HO－1表達(dá)上調(diào),發(fā)現(xiàn)HO－1的誘導(dǎo)對(duì)銀屑病樣皮損有治療作用并可影響動(dòng)物血清中TNF－α、IL－10分泌。1,2本研究擬通過研究HO－1對(duì)銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF－α、IL－10的影響,探討HO－1抗銀屑病的機(jī)制并為其可能的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 尋常型銀屑病患者20例均來自本科門診和病房,并經(jīng)臨床和病理確診,均為進(jìn)行期,其中男13例,女7例,年齡18～52歲,平均34.6歲,病程3天～18年。所有患者均無其他自身免疫性疾病及合并癥,受試前臨床檢查未發(fā)現(xiàn)急性期感染征象,3個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、維A酸類和免疫抑制劑等,3個(gè)月內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素制劑,不伴明顯的肝腎功能異常。正常人10例來自健康獻(xiàn)血者,男6例,女4例,年齡19～46歲,平均33.7歲。該研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購(gòu)自上海華精生物高科技有限公司,RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司,HO－1特異性誘導(dǎo)劑－鈷原卟啉(CoPP)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,人TNF－αELISA試劑盒、IL－10 ELISA試劑盒為深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝。

1.3 外周血PBMC分離 取患者與正常人靜脈血10 mL,肝素抗凝,常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離PBMC,臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95%,用RPMI 1640配成1 ×106/m L細(xì)胞懸液。

1.4 外周血PBMC培養(yǎng) 正常人和銀屑病患者的PBMC進(jìn)行24孔板培養(yǎng),再分別分為5組:對(duì)照組, CoPP5組,CoPP10組,CoPP20組和CoPP50組。對(duì)照組加2 m L的細(xì)胞懸液,余4組每孔分別加1μmol/ mL CoPP 10μL、20μL、40μL、100μL,最后每孔加細(xì)胞懸液至總體積2 m L。CoPP的終濃度分別為5 μmol/L(CoPP5組)、10μmol/L(CoPP10組)、20 μmol/L(CoPP20組)和50μmol/L(CoPP50組)。37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)48 h,離心后收集上清液,－20℃凍存,用于細(xì)胞因子的檢測(cè),收集細(xì)胞置－80℃保存,用于Western Blot檢測(cè)。

1.5 Western Blot方法檢測(cè)PBMC中HO－1蛋白 應(yīng)用RIPA蛋白裂解液從PBMC中提取蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用5%脫脂奶粉封閉,加入β－actin和HO－1 mAb(1∶500), 4℃孵育過夜,洗膜,然后加入1∶500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記二抗,加DAB顯色。以Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)照相、測(cè)定條帶的光密度,計(jì)算目標(biāo)蛋白和β－actin蛋白之間光密度(譜帶面積與光密度乘積)比值,每組樣本重復(fù)4次。

1.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF－α、IL－10 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從中求得培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用方差分析和t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC中HO－1蛋白的表達(dá) 見圖1、2。在正常人組,對(duì)照組PBMC中HO－1幾乎無表達(dá),而在4個(gè)CoPP處理組,HO－1蛋白表達(dá)明顯增高。在銀屑病組,對(duì)照組PBMC中HO－1蛋白輕度表達(dá),而在4個(gè)CoPP處理組HO－1蛋白顯著增高。無論是正常人還是銀屑病患者,PBMC中HO－1的表達(dá)量隨著CoPP劑量的增加而增加。

圖1 正常人PBMC中HO－1蛋白的表達(dá)

圖2 銀屑病患者PBMC中HO－1蛋白的表達(dá)

2.2 ELISA法檢測(cè)HO－1對(duì)PBMC分泌TNF－α的影響 見表1。與對(duì)照組比較,CoPP在4種濃度下所誘導(dǎo)的HO－1均可抑制TNF－α的分泌(P＜0.05),但CoPP 10μmol/L組與CoPP 5μmol/L組間差異有顯著性(P＜0.05),CoPP 10μmol/L組與20μmol/L組和50μmol/L組間則無顯著性差異(P＞0.05),說明在CoPP濃度為10μmol/L時(shí)所誘導(dǎo)的HO－1對(duì)TNF－α的抑制作用達(dá)到高峰,HO－1的進(jìn)一步增加不會(huì)對(duì)TNF－α有更顯著的影響。

表1 HO－1對(duì)銀屑病患者和正常人PBMC產(chǎn)生TNF－α、IL－10的影響

2.3 ELISA法檢測(cè)HO－1對(duì)PBMC分泌IL－10的影響 見表1。與對(duì)照組比較,CoPP在4種濃度下所誘導(dǎo)的HO－1均可增強(qiáng)IL－10的分泌(P＜0.05),同樣在CoPP濃度為10μmol/L時(shí)作用達(dá)到高峰。

3 討論

TNF－α是巨噬細(xì)胞受到刺激而釋放的細(xì)胞因子,研究表明銀屑病皮損中存在著TNF－α的過量表達(dá),且隨病情的好轉(zhuǎn),表達(dá)量相應(yīng)下降。目前TNF－α拮抗劑已經(jīng)成功的應(yīng)用于臨床,成為治療嚴(yán)重銀屑病的新型生物制劑。3IL－10是一種具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子,可抑制Th1細(xì)胞增殖與IL－2、IFN－γ等細(xì)胞因子分泌。有研究報(bào)道銀屑病患者在治療前血清IL－10水平明顯降低,經(jīng)治療后外周血單核細(xì)胞中IL－10 mRNA水平升高。4Lee等5報(bào)道,銀屑病患者全血IL－10表達(dá)水平較健康對(duì)照降低。

HO－1催化血紅素氧化降解為鐵離子、CO和膽綠素。HO－1是HO的可誘導(dǎo)型,通過血紅素的代謝產(chǎn)物而發(fā)揮作用。研究表明在許多病理生理狀態(tài)下, HO－1具有細(xì)胞保護(hù)、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗增殖、抗凋亡和免疫抑制的作用。6－9我們前期在檢測(cè)銀屑病患者與正常人PBMC HO－1 mRNA和免疫組化檢測(cè)HO－1蛋白的實(shí)驗(yàn)中未見明顯差異。10本研究中發(fā)現(xiàn)銀屑病患者組PBMC中HO－1蛋白的表達(dá)略高于正常對(duì)照組。

銀屑病患者TNF－α的分泌量均高于對(duì)照組,IL－10的分泌量相對(duì)低于對(duì)照組,這與以往的相關(guān)研究結(jié)果一致；不同濃度的CoPP誘導(dǎo)的HO－1均可抑制TNF－α的分泌,誘導(dǎo)IL－10的產(chǎn)生,這與我們前期在動(dòng)物模型中的研究結(jié)果一致。2有研究報(bào)道在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中HO－1可減少TNF－α的分泌和增強(qiáng)的IL－10的的分泌,11而且HO－1缺陷的小鼠脾細(xì)胞TNF－α分泌顯著增加,12提示HO－1可能介導(dǎo)了抗炎反應(yīng)。其作用可能與HO－1催化血紅素氧合酶代謝所釋放的CO有關(guān),CO可通過p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化作用抑制LPS激活的巨噬細(xì)胞TNF－α和IL－1β分泌而增加IL－10的分泌。13

本研究發(fā)現(xiàn),無論是正常人還是銀屑病患者,不同濃度的CoPP均可誘導(dǎo)HO－1的表達(dá),且表達(dá)強(qiáng)度與CoPP濃度呈劑量依賴關(guān)系。CoPP所誘導(dǎo)的HO－1對(duì)TNF－α和IL－10的影響在其濃度為10μmol/L時(shí)達(dá)到高峰,繼續(xù)增加CoPP的濃度雖然可使HO－1的表達(dá)量增多,但對(duì)TNF－α和IL－10的影響卻不顯著,也許在此濃度以后隨濃度的增加,HO－1的作用逐漸減弱,對(duì)此有待進(jìn)一步研究。

本研究提示HO－1能夠調(diào)節(jié)銀屑病患者TNF－α和IL－10的分泌,從而對(duì)銀屑病可能起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,相信隨著對(duì)HO－1作用機(jī)制的深入研究,有望為銀屑病治療提供一種新途徑。

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(收稿:2013－08－19 修回:2013－09－26)

Im paction of hemeoxygenase－1 on the production of TNF－αand IL－10 in peripheral blood mononuclear cells of patients w ith psoriasis

MA Liang-juan,SONG Ying,YAO Jun-ying,et al.Department ofDermatology,The Second Affiliated Hospital ofHarbin Medical University,Harbin,150081

Objective:To investigate the effects of hemeoxygenase－1(HO－1)on the production of TNF－αand IL－10 by peripheral blood mononuclear cell(PBMC)in the patientswith psoriasis vulgaris.Methods: PBMCswere obtained and cultured.The expression of HO－1 protein was tested byWestern－blot.The level of TNF－αand IL－10 in the supernatants of cultured PBMC wasmeasured by a specific enzyme－linked immunosorbent assay.Results:CoPP induced the expression of HO－1 protein in PBMC of both patients and controls in a dose－dependentmanner.The secretion of HO－1 protein induced by different concentration of CoPP inhibited the secretion levels of TNF－αand enhanced the secretion of IL－10,and themaximum effective concentration was 10μmol/L.Conclusion:HO－1 can be induced from the secretion of TNF－αand IL－10 PBMC in patientswith psoriasis vulgaris,thus it is possible thatHO－1may be played in a role of anti－inflammatory and immunomodulatory function in psoriasis.

psoriasis；HO－1；PBMC；TNF－α；IL－10

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào):12511186)黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(編號(hào):2010－063)

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科,150081 2黑龍江省醫(yī)院皮膚科,哈爾濱,150036?通信作者