ADAM33在IL-4刺激的人氣道平滑肌細(xì)胞中對NF-κB和TGF-β1表達(dá)的影響

陶 韜，朱小華，古嫦英，張孝彬，郭 武，廖秀清

(重慶市涪陵中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶408000)

哮喘的病因復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，以氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特點(diǎn)，多種細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與其發(fā)生發(fā)展過程，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。在氣道重塑過程中氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增生、肥大，導(dǎo)致氣流阻塞、持續(xù)氣道高反應(yīng)性，因此，研究ASMCs 增殖的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路對完善哮喘發(fā)病機(jī)制有重要意義。哮喘以Th2 型免疫反應(yīng)為主，而白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是主要的Th2 型細(xì)胞因子［1-3］。解整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotease，ADAM33)的多態(tài)性與哮喘的嚴(yán)重程度、易感性、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等相關(guān)［1，3-7］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是氣道重塑的重要細(xì)胞因子，可刺激氣道和血管平滑肌細(xì)胞增生和肥大［2，8］。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與哮喘也密切相關(guān)［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 可引起HASMCs 中ADAM33 表達(dá)增高，并呈濃度依耐性，故本研究以濃度為50μg/L 的IL-4 刺激ASMCs，初步探討ADAM33 在人氣道平滑肌細(xì)胞IL-4/NF-κB/TGF-β1 信號通路中的作用，為進(jìn)一步完善哮喘的發(fā)病機(jī)制和防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人氣道平滑肌細(xì)胞HASMCs(上海眾華生物科技有限公司)，人IL-4(PeproTech 公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司)，Lipofectamin RNAiMAX Reagent 試劑盒(Invitrogen 公司)，RNA提取試劑盒(Omega 公司)，Primscript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒和SYBR Premix ExⅡTaq熒光定量 PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)，兔抗ADAM33抗體(Gene Tex 公司)，兔抗TGF-β1 抗體(Bioworld 公司)，兔抗NF-κB p65 抗體和兔抗GAPDH抗體(Immunoway 公司);蛋白定量試劑盒(Pierce 公司)，蛋白印跡發(fā)光液和PVDF 膜(Millipore 公司)，余Western blot 相關(guān)的試劑(碧云天公司);引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)，ADAM33-siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成(表2)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人氣道平滑肌細(xì)胞HASMCs 用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞處于增殖對數(shù)期時(shí)消化細(xì)胞，每孔加入1 ×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，共2.5 mL，6 h 后加入50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs，以未刺激細(xì)胞組為對照，24 h 后提取RNA 和蛋白。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs 24 h 后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，采用RNAi MAX 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，設(shè)干擾組、陰性對照組和空白對照組，Opti-MEM 500 μL、siRNA 1.5 μL、RNAi MAX 5 μL 混勻，室溫靜止20 min 后加入各孔，48 h 后提取RNA 和蛋白。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 The primers used in the experiment

表2 ADAM33 干擾RNA 序列Table 2 ADAM33 interfering RNA sequences

1.2.3 RNA 抽提:IL-4 刺激HASMCs 48 h 和轉(zhuǎn)染48 h 后提取RNA，RNA 提取按試劑盒說明書進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳，分光光度計(jì)檢測濃度和純度。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):去除基因組DNA 反應(yīng):5 ×去基因組DNA 緩沖液2.0 μL，DNA 酶1.0 μL，RNA 1 μg，去RNA 酶的去離子水加到10 μL 體系，條件為42 ℃2 min;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):去除基因組DNA 反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄酶混合物Ⅰ1 μL，反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物預(yù)混物1 μL，5 ×反轉(zhuǎn)錄引物緩沖液Ⅱ4 μL，去RNA 酶的去離子水4 μL，總反應(yīng)體積為20 μL，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測IL-4 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 mRNA 表達(dá)的影響:將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 稀釋10 倍后進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增體系按說明書進(jìn)行，擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃10 min 后，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 循環(huán)。插入溶解曲線。每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 Western blot 法檢測IL-4 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 蛋白表達(dá)的影響:IL-4 刺激HASMCs 48 h后，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，取蛋白提取物50 μg，100 ℃變性5 min 后在8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，在80 V 恒壓下濃縮30 min，100 V 恒壓下分離90 min，切膠，在250 mA電流下轉(zhuǎn)膜90 min，封閉2 h，兔抗ADAM33(1∶500稀釋)4 ℃過夜，TBST 洗10 min×3，與二抗在室溫下反應(yīng)1.5 h，三乙醇胺緩沖液吐溫－20 洗10 min ×3，ECL 法發(fā)光，同時(shí)以GAPDH(1∶800 稀釋)為對照。凝膠成像儀采集圖像，Quantity One 軟件測量灰度值，目的蛋白吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 法和Western blot 法檢測ADAM33-siRNA 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 的抑制率:IL-4 刺激HASMCs 24 h 后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ADAM33-siRNA-575，48 h 后提取RNA 和蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR 法和Western blot 法檢測抑制率，步驟同前。

1.2.8 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后對TGF-β1、NF-κB mRNA 表達(dá)的影響:沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測TGF-β1 和NF-κB mRNA 的表達(dá)情況，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同前。

1.2.9 Western blot 法檢測沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后對TGF-β1、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ADAM33-siRNA-575 48 h 后提取蛋白，取蛋白提取物50 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，在80 V 恒壓下濃縮30 min，100 V 恒壓下分離90 min，切膠，在250 mA 電流下，TGF-β1 轉(zhuǎn)膜45 min，NF-κB 轉(zhuǎn)膜70 min，封閉2 h，兔抗TGF-β1、NF-κB P65(均1∶500稀釋)4 ℃過夜，三乙醇胺緩沖液吐溫－20 ℃洗10 min ×3，與二抗在室溫下反應(yīng)1.5 h，TBST 洗10 min×3，ECL 法顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析，ADAM33、TGF-β1、NF-κB mRNA 和蛋白采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間的比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL-4 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 mRNA表達(dá)的影響

用IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，刺激組ADAM33 mRNA 的相對表達(dá)量為4.415 ±0.610 顯著高于未刺激組的1.012 ±0.193(P＜0.05)。

2.2 IL-4 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 蛋白表達(dá)的影響

用IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，刺激組ADAM33蛋白的相對表達(dá)量為0.695 ±0.007，顯著高于未刺激組的0.210 ±0.018(P＜0.05)(圖1)。

圖1 IL-4 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 蛋白表達(dá)的影響Fig 1 The effct of IL-4 on the expression of ADAM33 protein in human airway smooth muscle cells

2.3 ADAM33-siRNA 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 的抑制作用

轉(zhuǎn)染48 h 后，干擾組組、陰性對照組和空白對照組ADAM33 mRNA 的表達(dá)量分別為0.193 ±0.046、1.02 ±0.241 和1.054 ±0.147，干擾組與陰性對照組相比表達(dá)下調(diào)約81.08%(P＜0.05);干擾組ADAM33 蛋白的表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P＜0.05);空白對照組和陰性對照組在mRNA 水平和蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.4 沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后對TGF-β1、NF-κB mRNA 表達(dá)的影響

圖2 ADAM33-siRNA 對人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 蛋白表達(dá)的影響Fig 2 The effct of ADAM33-siRNA on the expression of ADAM33 protein in human airway smooth muscle cells

沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后，干擾組、陰性對照組和空白對照組TGF-β1 mRNA 的表達(dá)量分別為0.602 ± 0.024、1.01 ± 0.176 和1.239 ±0.171，NF-κB mRNA 的表達(dá)量分別為0.54 ±0.08、1.014 ±0.21 和1.049 ±0.378。與空白對照組和陰性對照組相比較，干擾組TGF-β1 mRNA 和NF-κB mRNA 表達(dá)下降(P＜0.05)，空白對照組和陰性對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 沉默人氣道平滑肌細(xì)胞ADAM33 后對TGF-β1、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響

干擾組、陰性對照組、空白對照組TGF-β1 蛋白的表達(dá)量分別為0.227 ±0.016、0.7 ±0.048、0.715 ±0.025，NF-κB 蛋白的表達(dá)量分別為0.335 ±0.048、0.922 ±0.04、0.943 ±0.046。與空白對照組和陰性對照組相比較，干擾組TGF-β1 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，空白對照組和陰性對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 ADAM33 對人氣道平滑肌細(xì)胞TGF-β1 和NF-κB 蛋白表達(dá)的影響Fig 3 The effect of ADAM33 on the expression of TGF-β1 and NF-κB protein in human airway smooth muscle cells

3 討論

哮喘是以氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特點(diǎn)的慢性氣道非特異性炎性反應(yīng)疾病，多種細(xì)胞(包括平滑肌細(xì)胞)、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與其發(fā)生發(fā)展過程，其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，對平滑肌細(xì)胞的保護(hù)可能會成為防治哮喘的主要方向。研究表明哮喘患者IL-4 高表達(dá)，并與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)［1-3］。以不同濃度的IL-4 或/和IL-13 刺激人肺成纖維細(xì)胞MRC-5，能促進(jìn)ADAM33 的表達(dá)，并呈濃度依耐性和時(shí)間依賴性［10］。本實(shí)驗(yàn)組前期研究也發(fā)現(xiàn)，IL-4 可導(dǎo)致HASMCs 中ADAM33 表達(dá)增高，并呈濃度依耐性，提示IL-4 和ADAM33 在氣道重塑過程中可能起著重要的作用，故本實(shí)驗(yàn)后繼研究以50 μg/L 的IL-4 為刺激濃度，本研究發(fā)現(xiàn)50 μg/L 的IL-4 刺激HASMCs 24 h 后，在mRNA 水平和蛋白水平，均明顯上調(diào)了ADAM33 的表達(dá)，表明細(xì)胞因子IL-4 可促進(jìn)ADAM33 的表達(dá)。

ADAM33 基因可能與哮喘有關(guān)，主要表達(dá)在肺成纖維細(xì)胞和支氣管的平滑肌細(xì)胞，而在上皮細(xì)胞和T 細(xì)胞中無表達(dá)［4］。但亦有研究表明ADAM33還表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞［5，11］。大多研究結(jié)果表明ADAM33 的多態(tài)性與哮喘相關(guān)［1，3-7］，但亦有研究表明與哮喘的嚴(yán)重程度無關(guān)［5，12］。在不同地區(qū)、不同種族人群中，SNPs 分布也不完全相同［6］，故需要大量研究來驗(yàn)證ADAM33 在哮喘的作用。由于ADAM33很可能介導(dǎo)了氣道重塑，研究其機(jī)制并針對此基因的治療有望為哮喘患者帶來最大利益。

TGF-β1 是氣道重塑的重要細(xì)胞因子，與氣道基底膜厚度和哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［2，8］，前期研究也發(fā)現(xiàn)IL-4 可引起HASMCs 中TGF-β1 的表達(dá)上調(diào)。但有研究表明TGF-β1 可抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)，故TGF-β1 能否作為哮喘病情分級、療效和評價(jià)預(yù)后的可靠指標(biāo)，尚需大量的研究。IL-4 與TGF-β1在誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中具有協(xié)同作用［2］，TGF-β2可誘導(dǎo)支氣管成纖維細(xì)胞ADAM33 胞外域的脫落［9］，而ADAM33 的金屬蛋白酶活性可促使膜結(jié)合的生長因子(如EGF、TGF、IGF)及其受體釋放，成為可溶性形式，刺激氣道間質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，表明三者之間存在一定的關(guān)系。而本研究發(fā)現(xiàn)在干擾ADAM33 后，TGF-β1 的表達(dá)量也下降，表明他們之間可能存在正負(fù)反饋機(jī)制或信號級聯(lián)放大效應(yīng)，兩者之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

NF-κB 參與基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控多種細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、炎性介質(zhì)等基因的轉(zhuǎn)錄［13］。NF-κB調(diào)控的炎性蛋白囊括了絕大多數(shù)介導(dǎo)哮喘的炎性蛋白，它的活化不僅通過誘導(dǎo)這些炎性蛋白的表達(dá)參與哮喘的氣道慢性炎性反應(yīng)，而且還通過其正反饋環(huán)路導(dǎo)致炎性反應(yīng)過程的放大。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)也與ADAM33 相關(guān)，抑制ADAM33 表達(dá)后，NF-κB 的表達(dá)也降低，表明NF-κB 可能是ADAM33 下游的一個(gè)重要信號分子。

綜上所述，哮喘治療中最大的問題是氣道重塑，目前還沒有針對氣道重塑的有效治療手段，氣道平滑肌細(xì)胞的增殖在哮喘氣道重塑中起著重要的作用，而本研究發(fā)現(xiàn)ADAM33 可能是IL-4 調(diào)節(jié)人氣道平滑肌細(xì)胞NF-κB/TGF-β1 信號通路中的一個(gè)關(guān)鍵信號分子，故有望成為防治哮喘的重要靶點(diǎn)。

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