大黃素抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和抑制Survivin及XIAP的蛋白表達(dá)

孟智超，李淑玲，肖建英*

(遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州121001)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病，其發(fā)病隱蔽，許多卵巢癌被診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，導(dǎo)致患者生存率下降，嚴(yán)重威脅婦女的生命和健康［1］。目前卵巢癌的治療方法為以手術(shù)治療為主，化學(xué)藥物治療為輔的的綜合治療。紫杉醇聯(lián)合鉑類化療己成為卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，然而對(duì)化療的獲得性耐藥是卵巢癌患者治療失敗和死亡的主要原因，嚴(yán)重限制了紫杉醇的應(yīng)用和療效［2］。大黃素(emodin)是從大黃、虎杖等藥物中提取的游離型蒽醌類成分，研究表明大黃素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)效應(yīng)，其抗腫瘤作用逐漸受到人們的重視［3-5］。本實(shí)驗(yàn)研究了大黃素對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的增殖和凋亡影響，對(duì)大黃素在卵巢癌腫瘤治療中的應(yīng)用具有重要參考價(jià)值，為進(jìn)一步研究卵巢癌化療耐藥的相關(guān)機(jī)制和提高療效及改善預(yù)后具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大黃素(Sigma 公司);胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司);Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Bipec 公司);羊多抗Survivin、兔多抗XIAP和鼠單抗β-actin 抗體(Santa Cruz 公司);HRP 標(biāo)記的山羊抗兔，抗鼠IgG 和鼠抗山羊IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 試劑盒(Takara 公司);ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人卵巢癌細(xì)胞SKOV3(北京市腫瘤研究所)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，以1 ×105/mL 濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后分組給予藥物處理:對(duì)照組DMSO;12.5、25 和50 μmol/L 大黃素組。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)增殖期的SKOV3 細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞103/孔接種于96 孔板，每孔200 μL。細(xì)胞貼壁后分別給予不同濃度的藥物處理24 h。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，棄上清，換等量無血清DMEM，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)37 ℃繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩15 min，使甲攢充分溶解。選擇490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值，參比波長(zhǎng)為630 nm，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=1 －(對(duì)照組A 值－ 實(shí)驗(yàn)組A 值)/對(duì)照組A 值×100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)增殖期的SKOV3 細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的大黃素干預(yù)SIRT1 的活性，上述細(xì)胞在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰蛋白酶-EDTA 消化離心細(xì)胞，PBS 洗滌2 次;加入FITC-annexin 和100 μg/mL PI染液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，室溫孵育15 min，將各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，CellQuest 分析軟件分析各組細(xì)胞期凋亡率。

1.5 RT-PCR 方法檢測(cè)Survivin 和XIAP mRNA表達(dá)水平

采用Trizol 一步法提取加藥處理24 h 的SKOV3細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA 濃度。按TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。PCR 引物序列Survivin(5'-CCAAGGTCTGG CTCGTTCTCATG-3'，5'-GCGCACTTTCTCCGCAGTTT C-3'，357 bp);XIAP(5'-GTGATCGTGCCTGGTCAG AA-3'，5'-CAAGGGTCTTCACTGGGCTT-3'，313 bp);β-actin(5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATC TA-3'，5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG GG-3'，661 bp);PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃30 s;55 ℃30 s;72 ℃1 min;35 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物10 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后拍照，測(cè)量吸光度值，mRNA 表達(dá)水平以每一樣品與β-actin 吸光度比值表示。

1.6 Western blot 檢測(cè)Survivin 和XIAP 的蛋白表達(dá)

蛋白裂解液RIPA 提取加藥處理24 h 后的各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加2 × SDS 樣品緩沖液，煮沸5 min，離心后上樣，10% SDS-PAGE 電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST(pH 7.4)將室溫封閉濾膜2 h，濾膜再分別與Survivin 和XIAP(稀釋比1∶500)及β-actin(稀釋比1∶1 000)4 ℃溫育過夜。TBST 洗膜3 次后，HRP 偶聯(lián)的IgG 作為二抗(稀釋比1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜3 次后，ECL 發(fā)光法顯色。Image J分析密度，計(jì)算吸光值，內(nèi)參采用β-actin。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

與對(duì)照組相比，12.5、25 和50 μmol/L 大黃素分別作用SKOV3 細(xì)胞24 h 后，各組細(xì)胞增殖率隨著藥物濃度的升高而降低(P＜0.01)(圖1，表1)。

2.2 大黃素誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，大黃素各組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)(圖2，表1)。

2.3 大黃素抑制SKOV3 細(xì)胞中Survivin 和XIAP mRNA 表達(dá)

與對(duì)照組比較，大黃素作用于SKOV3 細(xì)胞后，Survivin 和XIAP 的mRNA 表達(dá)明顯降低，且隨劑量增加表達(dá)越低(P＜0.01)(圖3，表2)。

圖1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)作用SKOV3 細(xì)胞的細(xì)胞增殖率變化Fig 1 The SKOV3 cells proliferation rate in the presence of different concentration of emodin(±s，n=3)

表1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖和凋亡影響Table 1 The proliferation rate and apoptosis rate of SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，%，n=3)

表1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖和凋亡影響Table 1 The proliferation rate and apoptosis rate of SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，%，n=3)

＊P＜0.01 compared with control group.

groups(emodin μmol/L)proliferation rateapoptosis rate control98.92 ±4.341.52 ±0.01 12.590.53 ±4.12*6.38 ±0.56*2573.23 ±2.31*20.33 ±2.22*5049.89 ±2.33*34.68 ±3.81*

圖2 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)作用SKOV3 細(xì)胞后引起細(xì)胞凋亡Fig 2 The SKOV3 cells apoptosis in the presence of different concentration of emodin

表2 SKOV3 細(xì)胞經(jīng)emodin(0、12.5、25 和50 μmol/L)處理后Survivin 和XIAP 的mRNA 和蛋白表達(dá)Table 2 mRNA and protein expression levels of Survivin and XIAP in SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，n=3)

表2 SKOV3 細(xì)胞經(jīng)emodin(0、12.5、25 和50 μmol/L)處理后Survivin 和XIAP 的mRNA 和蛋白表達(dá)Table 2 mRNA and protein expression levels of Survivin and XIAP in SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，n=3)

＊P＜0.01，compared with control group.

group(emodin μmol/L)Survivin mRNAXIAP mRNASurvivin proteinXIAP protein control0.438 ±0.0090.533 ±0.0070.532 ±0.0110.624 ±0.008 12.50.321 ±0.0050.419 ±0.003*0.032 ±0.005*0.443 ±0.008*250.211 ±0.005*0.204 ±0.004*0.026 ±0.005*0.033 ±0.004*500.124 ±0.003*0.103 ±0.002*0.011 ±0.003*0.018 ±0.004*

2.4 大黃素抑制SKOV3 細(xì)胞中Survivin 和XIAP的蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，各劑量大黃素作用SKOV3 細(xì)胞后Survivin 和XIAP 的蛋白表達(dá)明顯降低，且隨劑量增加表達(dá)越低(P＜0.01)(圖4，表2)。

圖3 不同濃度大黃素作用SKOV3 細(xì)胞后Survivin和XIAP 的mRNA 表達(dá)Fig 3 The Survivin and XIAP mRNA expression levels in SKOV3 cells

圖4 不同濃度大黃素作用SKOV3 細(xì)胞后Survivin和XIAP 的蛋白表達(dá)Fig 4 The Survivin and XIAP protein expression levels in SKOV3 cells

3 討論

近年來，對(duì)大黃素及其衍生物的性能及藥理研究逐步從傳統(tǒng)的免疫領(lǐng)域擴(kuò)展到腫瘤治療領(lǐng)域，探究其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用機(jī)理己取得一定進(jìn)展［4］。研究證明大黃素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在乳腺癌［6］、卵巢癌［2］、頭頸部癌［7］、胃癌［8］、肝癌［9-10］和前列腺癌［11］中，大黃素明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。MTT 法結(jié)果表明大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有濃度依賴性生長(zhǎng)抑制作用［2］。體外研究表明，大黃素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，通過不同的凋亡途徑來發(fā)揮作用［6，8-10］。IAP 家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白。Survivin 和XIAP 是IAPs家族的兩個(gè)重要成員，可分別通過腫瘤壞死因子受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和caspases 蛋白酶激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［12-13］。Survivin 具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖雙重作用［1，14］。Survivin 在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，胚胎組織中表達(dá)，分化成熟的組織中幾乎不表達(dá)。但是當(dāng)細(xì)胞惡變?yōu)槟[瘤細(xì)胞時(shí)，Survivin 又將重新表達(dá)。XIAP 作為一個(gè)有力的凋亡抑制因子，在許多惡性腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)，是評(píng)估腫瘤惡性程度及預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)［12-13］。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了大黃素對(duì)SKOV3 細(xì)胞的凋亡影響，結(jié)果顯示大黃素可以促進(jìn)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡，降低Survivin 和XIAP mRNAs 和蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果提示大黃素誘導(dǎo)凋亡可能與抑制Survivin 和XIAP 表達(dá)密切相關(guān)［12］。

綜上所述，大黃素可以抑制SKOV3 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有濃度依賴性，其機(jī)制可能通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin 和XIAP 表達(dá)有關(guān)。因此，研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)制定卵巢癌合理有效的綜合治療方案及改善預(yù)后和提高患者的生活質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

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