銀杏內(nèi)酯注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的探討

李婧, 孫文霞

（1.西南民族大學(xué), 四川 成都 610041; 2.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所, 四川 成都 610051)

銀杏內(nèi)酯注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的探討

李婧1, 孫文霞2

（1.西南民族大學(xué), 四川 成都 610041; 2.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所, 四川 成都 610051)

目的: 建立銀杏內(nèi)酯注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法, 保證其安全性. 方法: 按照《中國(guó)藥典》2010 年版二部中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法, 確定銀杏內(nèi)酯注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值, 并對(duì)3批樣品進(jìn)行檢查. 結(jié)果 將銀杏內(nèi)酯注射液稀釋15倍對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾作用, 其細(xì)菌內(nèi)毒素限值可定為1.5 EU/mg. 結(jié)論: 所建立的方法快速、簡(jiǎn)便、具有可行性,可用于控制銀杏內(nèi)酯注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的量.

銀杏內(nèi)酯注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；鱟試劑

銀杏葉提取物是治療心腦血管疾病的首選天然藥物, 廣泛用于治療心腦血管疾病, 是全球使用量最大的植物藥, 具有卓越的療效和安全性. 銀杏內(nèi)酯是銀杏葉提取物最重要的有效成分. 銀杏內(nèi)酯注射液的主要活性成分為銀杏總內(nèi)酯（ginkgolide), 由倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯組成, 具有很強(qiáng)的抗血小板活化因子活性[1-4]. 具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效, 用于中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期淤血阻絡(luò)癥如半身不遂, 口舌歪斜, 肢體麻木等, 適用于急性期腦梗死和恢復(fù)期腦梗死患者, 有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景. 本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》[5]2010年版二部“附錄XI E 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法)”和“附錄XIX F細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”, 以及2005年版《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[6]中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求, 對(duì)銀杏內(nèi)酯注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了考察, 為銀杏內(nèi)酯注射液的質(zhì)量控制提供參考. 現(xiàn)介紹如下.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥與試劑

BET用水（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水): 批號(hào)1101040, 規(guī)格5 ml/支, 由廣東湛江安度斯生物有限公司提供. CSE (細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品): 批號(hào)為150601-201069, 規(guī)格為120 EU/支, 由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供. 靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑(TAL): 批號(hào)為100101, 規(guī)格為0.1ml/支, 由湛江安度斯生物有限公司提供；批號(hào)為1101140, 規(guī)格為0.1ml/支, 由湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn). 銀杏內(nèi)酯注射液: 規(guī)格10mg/2ml, 批號(hào)110801、110802、110803, 自制.

1.2 儀器

202-I型電熱恒溫干燥箱(上海產(chǎn)), Vortex-Genie 2/2T型旋渦振蕩器(美國(guó) Scientific Industries), 19A型恒溫水浴系統(tǒng)（德國(guó)Julabo公司). 所有玻璃器皿均在250°C下干燥2h.

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)鱟試劑的標(biāo)示靈敏度, 用BET水將CSE稀釋成 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25 λ 4個(gè)濃度, 按2010年版《中國(guó)藥典》依法操作. 每一濃度平行做4支, 同時(shí)用BET水做2支陰性對(duì)照, 并按式λC= antilg（∑X/4)計(jì)算λC值.根據(jù)中國(guó)藥典二部的要求: 當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ)時(shí), 方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查. 結(jié)果CSE濃度為2.0λ的反應(yīng)管均呈陽(yáng)性反應(yīng), CSE濃度為0.25 λ的反應(yīng)管和陰性對(duì)照管均呈陰性反應(yīng), 可見(jiàn)所采用的2批靈敏度為0.5EU/ml的鱟試劑可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查, 見(jiàn)表1.

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab. 1 Sensitivity recheck results of TAL

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L)的確定

本品擬臨床用法為: 靜脈滴注. 每次5支, 臨用前加于250毫升0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液中緩慢靜滴, 一日1次. 依據(jù)公式L=K／M, 式中 K為5.0 EU /kg·h, 表示人每公斤體重每小時(shí)可接受的內(nèi)毒素最大劑量；M 表示人用每公斤體重每小時(shí)給藥的最大劑量, 本品按照50 mg銀杏內(nèi)酯與250ml氯化鈉注射液( 限值為0.5 EU/ml) 靜脈滴注1h計(jì). (50*L+250*0.5)/60 kg·h=5 EU /kg·h, L= 3.5 EU /mg, 為了保證臨床用藥安全, 從嚴(yán)考慮, 將本品的限值定為 1.5 EU /mg.

2.3 干擾初篩試驗(yàn)

2.3.1 供試品的稀釋

最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ, L為1.5 EU /mg, 銀杏內(nèi)酯注射液的濃度c為5mg/ml. 分別計(jì)算出靈敏度為0.5, 0.25, 0.125, 0.06 EU/ml的TAL相應(yīng)的MVD, 用BET水將銀杏內(nèi)酯注射液按照以上4個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋, 備用.結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 不同λ鱟試劑所對(duì)應(yīng)的MVD結(jié)果Tab. 2 MVD for different TAL

2.3.2 供試品干擾初篩試驗(yàn)

取λ為 0.5 EU/ml的TAL 16支, 其中8支分別用 “2.3.1”項(xiàng)下的4個(gè)濃度的供試品溶液0.1 m1復(fù)溶, 再分別加入0.1 ml BET水, 每個(gè)濃度 2 支反應(yīng)管, 作為供試品陰性對(duì)照反應(yīng)管, 記作NPC；另外8支先分別用4個(gè)上述濃度的供試品溶液復(fù)溶, 再分別加入2λ即1.0 EU/ml的內(nèi)毒素溶液0.1 ml, 每個(gè)濃度 2 支反應(yīng)管, 作為供試品陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管, 記作PPC. 結(jié)果NPC均顯陰性, PPC均顯陽(yáng)性反應(yīng), 說(shuō)明供試品在稀釋15到120倍的濃度下應(yīng)該對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用. 結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Results of preparative interference test

2.4 供試品干擾確證試驗(yàn)

選取2個(gè)不同廠家的靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑, 用BET水分別把3批供試品稀釋15倍, 每一濃度平行做 4管, 同時(shí)用BET水做2支陰性對(duì)照（NC), 放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘, 觀察結(jié)果, 并按Es=antilg（∑X/4),計(jì)算Es和 Et. 見(jiàn)表4.

結(jié)果Es和Et均在 0.5λ～2.0λ 之間, Et/Es的值為 0.5～2.0 , 認(rèn)為銀杏內(nèi)酯注射液在稀釋15倍的濃度下對(duì)靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用.

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

用BET水把3批銀杏內(nèi)酯注射液稀釋15倍, 用靈敏度為 0. 5 EU/ml 的鱟試劑進(jìn)行檢查. 結(jié)果表明3批銀杏內(nèi)酯注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合要求. 見(jiàn)表5.

表4 干擾性試驗(yàn)的結(jié)果Tab. 4 Results of interference test

表5 3批供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab. 5 Bacterial endotoxins detection results of Ginkgolide injection

3 討論與結(jié)論

銀杏內(nèi)酯主要包括銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)脂M、銀杏內(nèi)脂J以及白果內(nèi)酯等有效成分, 這些成分具有廣泛的藥理活性, 如抗血管性癡呆[3], 抗血小板活化因子（PAF)作用, 因而可用于防治動(dòng)脈粥樣硬化, 抗心肌缺血和缺血再灌注損傷作用, 減輕老年癡呆癥狀等[7-11]. 銀杏內(nèi)酯B是鈣通道和血小板活化因子的拮抗劑, 具有抗氧化作用吧, 它可以減輕腦水腫, 改善局部腦微循環(huán), 減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng), 從而保護(hù)腦組織免受損傷[12-13]. 銀杏注射液具有降低血液粘滯度, 改善微循環(huán), 減少尿白蛋白, 保護(hù)腎功能等作用[14]. 因而銀杏內(nèi)酯資源的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用一直是中草藥研究的熱點(diǎn).

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素, 以判斷供試品中存在的細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的方法, 包括凝膠法和光度測(cè)定法, 具有方便、快捷、靈敏和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn), 目前越來(lái)越多的品種采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來(lái)控制注射制劑的質(zhì)量. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查必須排除外源性內(nèi)毒素干擾, 所以試驗(yàn)所用的玻璃器皿等均應(yīng)進(jìn)行高溫處理除去可能存在的外源性內(nèi)毒素, 先用自來(lái)水將其洗干凈并烘干水分, 然后用洗液浸泡4小時(shí), 再用自來(lái)水將殘余的洗液洗凈, 最后用新鮮蒸餾水沖洗, 置適宜的密閉金屬容器中迅速置烤箱中. 禁用超純水或久置的蒸餾水沖洗, 因?yàn)榧兓写嬖诘年庩?yáng)離子經(jīng)250℃高溫干烤不能完全被破壞, 會(huì)對(duì)鱟試劑酶反應(yīng)抑制或增強(qiáng)的反應(yīng).

白林等人[15]對(duì)銀杏內(nèi)酯B注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了研究, 銀杏內(nèi)酯B注射液的臨床用法用量為,成人 1 次 將40 mg加到500 ml氯化鈉注射液中, 靜脈滴注, 在計(jì)算限量時(shí)將500 ml氯化鈉注射液的內(nèi)毒素限量扣除, L氯化鈉為0.5 EU·m1, 筆者參考該了文獻(xiàn), 將銀杏內(nèi)酯注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為1.5 EU/mg. 干擾初篩試驗(yàn)是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗(yàn), 通過(guò)對(duì)一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng), 初步篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無(wú)干擾的濃度, 可減少干擾試驗(yàn)的盲目性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Es和Et均在 0.5λ～2.0λ 之間, Et/Es的值為0.5～2.0, 認(rèn)為銀杏內(nèi)酯注射液在稀釋15倍的濃度下對(duì)靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用. 銀杏內(nèi)酯注射液可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢查.

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Bacterial endotoxins test for Ginkgolide Injection

LI Jing1, SUN Wen-xia2
(1. Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University, Chengdu 610051, P.R.C.)

Objective: To establish a method to test bacteria1 endotoxin of Ginkgolide Injection．Methods: Referencing appendix ofChina Pharmacopoeia2010 edition, the method to test bacteria1 endotoxin for Ginkgolide Injection is researched．Result: It is proved that the product does not interfere with endotoxin, and the limit of bacterial endotoxin is 1.5 EU/mg．Conclusion: Bacteria endotoxins test can be feasibly done for Ginkgolide Injection.

Ginkgolide Injection；bacterial endotaxins test；tachypleus amebocyte lysate

R927.1, R93

A

1003-4271(2014)05-0715-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.05.15

2014-04-09

李婧(1985-), 女, 漢族, 四川人, 實(shí)驗(yàn)師. Email:27918716@qq.com.

孫文霞(1980-), 女, 漢族, 河北人, 助理研究員. Email: 39512193@qq.com.