熒光光譜法研究尼麥角林與牛血清白蛋白的相互作用

陳佰靈, 仇麗穎, 李婧, 劉暉, 郭芷含, 趙志剛

（西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041）

熒光光譜法研究尼麥角林與牛血清白蛋白的相互作用

陳佰靈, 仇麗穎, 李婧, 劉暉, 郭芷含, 趙志剛

（西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041）

目的: 模擬正常人體生理條件下, 采用熒光光譜技術(shù)研究尼麥角林與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的機(jī)制. 方法: 通過熒光光譜法確定尼麥角林對BSA熒光淬滅的機(jī)制, 采用Stern-volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程計算反應(yīng)的猝滅常數(shù)和形成常數(shù), 采用雙對數(shù)方程計算兩者結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù), 熱力學(xué)公式計算反應(yīng)前后焓變和熵變確定兩者結(jié)合的主要作用力類型. 結(jié)果: 尼麥角林在0.25×l0-4～2.25×l0-4mol·L-1濃度范圍內(nèi), 對BSA的內(nèi)源熒光有較強(qiáng)的淬滅作用, 淬滅類型屬于靜態(tài)熒光淬滅. 在溫度25℃和37℃時, 尼麥角林與BSA的結(jié)合常數(shù)分別為3.499×104L·mol-1和5.213×104L·mol-1, 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.21和1.25. 由熱力學(xué)參數(shù)焓變(ΔH=11.05 KJ·mol-1)大于零和熵變(ΔS=74.87 J·mol-1·K-1)大于零, 確定尼麥角林與BSA之間的作用力以疏水作用力為主. 結(jié)論: 尼麥角林與BSA通過疏水作用形成復(fù)合物, 經(jīng)靜態(tài)猝滅機(jī)制引起B(yǎng)SA內(nèi)源性熒光猝滅.

尼麥角林; 牛血清白蛋白; 熒光光譜法

尼麥角林(Nicergoline), 化學(xué)名為10α-甲氧基-1, 6-二甲基麥角林-8β-甲醇基-5-溴煙酸酯, 具有較強(qiáng)的α受體阻滯作用、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集和抗血栓作用, 能加強(qiáng)腦部新陳代謝和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)化, 增加血氧和葡萄糖的攝取及利用, 臨床上已成為阿爾茨海默癥、血管性癡呆、腦血管疾病、周圍血管疾病以及前庭中樞性平衡障礙等多種疾病的經(jīng)典用藥[1-3]. 血漿中的白蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能, 藥物與白蛋白結(jié)合后不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn), 起到藥物儲庫作用, 因此藥物與白蛋白結(jié)合能力的高低, 直接影響其臨床療效, 但尼麥角林是否能與白蛋白相互作用的研究尚未見報道. 本文選擇了與人血白蛋白具有高度同源性的牛血清白蛋白(BSA), 采用熒光光譜法研究尼麥角林與BSA相互作用的特征, 該結(jié)果可為探討尼麥角林在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝過程提供部分實(shí)驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù), 也為臨床合理用藥提供一定的參考.

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

CARY Eclipse熒光分光光度儀(美國, Varian公司), Unicam UV500紫外分光光度儀(美國, Thermo公司), PHS-3D型PH計(上海智光儀器儀表有限公司 ). HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司). 三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國, Bio-Rad公司), 牛血清白蛋白 (瑞士, Roche公司, 含量98%), 尼麥角林(四川大學(xué)華西藥學(xué)院天然藥化教研室, 含量99.5%), 除Tris為生化試劑外, 其余試劑均為分析純, 實(shí)驗用水為二次去離子水.

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

BSA溶液: 用Tris-HCl緩沖溶液(0.1 mol·L-1, 鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.4, 內(nèi)含0.1 mol·L-1NaCl維持離子強(qiáng)度)配成4.0×10－5mol·L-1儲備溶液. 尼麥角林溶液: 精密稱取尼麥角林適量, 用甲醇溶解配制成濃度為2.5×10-3mol·L-1的工作溶液, 4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 熒光光譜測定

分別在一系列容量瓶中各精密加入l mL 4.0×l0-5mol·L-1的BSA溶液, 依次加入0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 μL的2.5×10-3mol·L-1的尼麥角林溶液, 再分別加入0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH7.4, 內(nèi)含0.1 mol·L-1NaCl)緩沖溶液定容至10 mL, 搖勻, 臵于恒溫水浴鍋中在規(guī)定溫度下(25℃或37℃)孵育20min, 測定熒光光譜. 固定激發(fā)波長為278nm, 激發(fā), 發(fā)射狹縫均為5nm, 掃描熒光光譜并測量熒光強(qiáng)度. 測定溫度為25 ℃或37 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 尼麥角林與BSA熒光光譜對比

BSA分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能夠發(fā)射熒光, 因而BSA是內(nèi)源性熒光物質(zhì). 當(dāng)激發(fā)波長在278 nm時, BSA熒光發(fā)射峰在350 nm附近, 而尼麥角林熒光強(qiáng)度很弱, 因此不會對BSA的熒光產(chǎn)生干擾.

圖1 激發(fā)波長在278nm時BSA和尼麥角林的熒光光譜Fig.1 The fluorescence spectra of the BSA and Nicergoline at 278nm excitation

2.2 尼麥角林對BSA熒光光譜的影響

固定BSA的溶液濃度不變, 向其中加入不同體積的尼麥角林溶液, 結(jié)果隨著尼麥角林濃度的增加(終濃度依次為0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25×10-4mol·L-1), BSA最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低(見圖2). 實(shí)驗結(jié)果說明尼麥角林通過某種機(jī)制導(dǎo)致BSA的熒光被淬滅.

圖2 尼麥角林對BSA熒光發(fā)射光譜的影響Fig.2 Effect of Nicergoline on fluorescence emission spectra of BSA

2.3 尼麥角林對BSA的熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅作用可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅等[4-5]. 本文首先按照動態(tài)熒猝滅規(guī)律, 測定了常溫下(25 ℃)和正常生理條件下(37 ℃), 尼麥角林對BSA的熒光猝滅情況. 在動態(tài)猝滅過程中, 可利用Stern-volmer方程[5-6]:

方程中F0和F分別表示猝滅劑不存在和存在時BSA的熒光強(qiáng)度, [Q]是猝滅劑的濃度, 即本實(shí)驗中尼麥角林的濃度, Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)(單位L·mol-1), Kq為雙分子表觀猝滅速率常數(shù)(單位L·mol-1·s-1), τo是無猝滅劑時熒光分子平均壽命, 文獻(xiàn)[7-8]報道約為10-8s. 將F0/F對[Q]作圖進(jìn)行曲線擬合(圖3), 由直線的斜率可以求算出KSV, 進(jìn)一步求算出Kq(表1):

圖3 不同溫度條件下尼麥角林對BSA熒光猝滅Stern-Volmer方程曲線Fig.3 Stern-Volmer piots of BSA fluorescence quenched by nicergoline at different temperatures

表1 不同溫度條件下尼麥角林對BSA熒光猝滅常數(shù)Tab.1 quenching parameters of BSA reaction with nicergoline at different temperatures

由計算結(jié)果可知, 尼麥角林對BSA的猝滅過程速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于猝滅劑對生物大分子的動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)最大值2.0×1010mol-1·L·s-1, 說明動態(tài)猝滅不是引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因[8].

靜態(tài)猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程[6,8]進(jìn)行描述:

其中, F0、F 和[Q]意義同前, KLB為靜態(tài)猝滅過程中復(fù)合物的形成常數(shù)(單位L·mol-1). 應(yīng)用( F0- F)-1對[Q]-1作圖并進(jìn)行線性擬合(見圖4), 由直線的斜率和截距求算KLB

圖4 不同溫度條件下尼麥角林對BSA熒光猝滅Lineweaver-Burk方程曲線Fig.4 Lineweaver-Burk piots of BSA fluorescence quenched by nicergoline at different temperatures

表2 不同溫度條件下尼麥角林與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab.2 Binding constants and binding numbers for BSA reaction with nicergoline at different temperatures

2.4 尼麥角林與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

引用文獻(xiàn)報道[7-9]的公式(方程3)作圖并計算靜態(tài)猝滅過程蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)KA. 結(jié)果見圖5和表2.

圖5 不同溫度條件下尼麥角林對BSA熒光猝滅的雙倒數(shù)方程曲線Fig. 5 The double logarithmic plots of BSA fluorescence quenched by Nicergoline at different temperatures

2.5 尼麥角林與BSA的作用力類型

有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、范德華力、靜電作用力和氫鍵作用等. 由熱力學(xué)參數(shù)關(guān)系式(方程式4～6), 可以計算出尼麥角林與 BSA 相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值, 結(jié)果見表3.

表3 不同溫度條件下熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 The thermodynamic parameters at different temperatures

文獻(xiàn)報道判斷生物大分子與小分子的結(jié)合性質(zhì)有一定的熱力學(xué)規(guī)律[10-11], 若ΔH>0, ΔS>0, 則表現(xiàn)為疏水作用力; 若ΔH<0, ΔS>0, 則表現(xiàn)為靜電作用力; 若ΔH<0, ΔS<0, 則表現(xiàn)為氫鍵和范德華力. 由于尼麥角林與BSA反應(yīng)前后的ΔH>0, ΔS>0, 表明兩者之間的作用力以疏水作用為主.

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 尼麥角林對BSA的熒光猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅, 是由于兩者間通過分子間疏水作用力形成了無熒光的大分子復(fù)合物而產(chǎn)生的, 兩者的結(jié)合位點(diǎn)約為1. BSA通過與尼麥角林結(jié)合形成復(fù)合物, 能夠影響其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝, 進(jìn)而影響其藥理作用, 因此尼麥角林和BSA的相互作用結(jié)果對臨床用藥具有重要意義.但是尼麥角林結(jié)合在BSA哪個結(jié)構(gòu)域, 是否會對BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響, 以及多藥并服時是否會影響兩者之間的結(jié)合等問題還需要更加深入的研究.

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Study on interaction between nicergoline and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy

CHEN Bai-ling, QIU Li-ying, LI Jing, LIU Hui, GUO Zhi-han , ZHAO Zhi-gang
(School of Chemistry and Environmental Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:Under simulative physiological conditions, mechanism of interaction of bovine serum albumin (BSA) and Nicergoline was studied by fluorescence spectroscopy.Method:Fluorescence spectroscopy was used to determine the fluorescence quenching mechanism of BSA caused by Nicergoline. Stern-volmer equation and Lineweaver-Burk double reciprocal equation were applied to determine the dynamic and static quenching constants. Double logarithmic equation was used to calculate the number of binding sites and binding constants. The main binding force was discussed by thermodynamic equation.Results:Fluorescence quenching of BSA by Nicergoline was strong in 0.25×l0-4～2.25×l0-4mol·L range, and belonged to static quenching type. At 25℃ and 37℃, the binding constants (KA) between Nicergoline and BSA were 3.499×104L·mol-1and 5.213×104L·mol-1, and the binding sites were 1.21 and 1.25, respectively. According to the thermodynamic parameters, enthalpy change (ΔH=11.05 KJ·mol-1) and entropy change (ΔS=74.87 J·mol-1·K-1), the interaction between Nicergoline and BSA was driven mainly by hydrophobic force.Conclusion:Nicergoline quenchs the intrinsic fluorescence of BSA via static quenching mechanism, and the binding is mainly driven by hydrophobic interaction.

Nicergoline; bovine serum albumin; fluorescence spectrometry

R917

A

1003-4271(2014)04-0509-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.07

2014-04-08

仇麗穎(1980-), 女, 漢族, 沈陽人, 講師, 博士, 研究方向: 生物藥物分析; E-mail：qiu7992@sina.com.