五沒(méi)食子?；咸烟菍?duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

沈丹蓓 蔣明軍

五沒(méi)食子酰基葡萄糖對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響

沈丹蓓 蔣明軍

目的: 確定五沒(méi)食子?；咸烟菍?duì)瘢痕疙瘩細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法: 用細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期分析，細(xì)胞姬姆薩染色比較五沒(méi)食子?；咸烟?、五倍子單寧酸和秋水仙堿對(duì)瘢痕組織成纖維細(xì)胞，Hacat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在增殖與凋亡方面的影響。結(jié)果: 五沒(méi)食子?；咸烟菍?duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和黑素瘤A375細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)成纖維細(xì)胞的作用呈時(shí)間和劑量依賴性，對(duì)HaCat細(xì)胞的增殖呈雙相作用，低濃度為促進(jìn)作用，高濃度為抑制作用，可使增殖受抑制細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變，表現(xiàn)為S期阻滯。凋亡細(xì)胞顯著增加。結(jié)論: 五沒(méi)食子?；咸烟菍?duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，對(duì)治療瘢痕疙瘩可能是一個(gè)具有開發(fā)潛力的活性物質(zhì)。

五沒(méi)食子?；咸烟?； 增殖； 凋亡

單寧酸是中藥五倍子中的主要活性成分，五倍子單寧酸是一種混合物，包含有數(shù)種基本結(jié)構(gòu)相近的化合物，這些化合物在分子量、結(jié)構(gòu)和含量方面不同，使它們的生物活性產(chǎn)生差異。五沒(méi)食子?；咸烟腔蛟蜎](méi)食子鞣質(zhì)(PGG，Beta－1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－D－glucopyranose)分子結(jié)構(gòu)中有5個(gè)相同的由核心葡萄糖上的羥基與沒(méi)食子酸上的羧基縮合成的酯鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易水解，分子量為940，是單寧酸中的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗增殖等作用。1－3在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子中的單寧酸可以以時(shí)間和劑量相依賴的方式抑制異常瘢痕成纖維細(xì)胞的體外增殖。本次研究中我們主要觀察了PGG和單寧酸對(duì)瘢痕疙瘩不同來(lái)源細(xì)胞在增殖與凋亡方面的影響。探索PGG成為治療瘢痕疙瘩藥物的可能性。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 五倍子單寧酸由中國(guó)科學(xué)院江蘇省藥用植物研究中心袁昌齊研究員提供，PGG由美國(guó)邁阿密大學(xué)Hagerman教授贈(zèng)送，秋水仙堿購(gòu)于昆明制藥廠，甲基噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均為Sigma產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清(杭州四季青生物制品廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人黑素瘤A375細(xì)胞、人肝癌BEL7402細(xì)胞和人皮膚HaCat細(xì)胞來(lái)源于中科院上海細(xì)胞所。細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(100 U/m L青霉素，100μg/m L鏈霉素)，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞、增殖性瘢痕成纖維細(xì)胞、結(jié)締組織痣成纖維細(xì)胞和正常人皮膚成纖維細(xì)胞從我所門診外科手術(shù)切除的標(biāo)本中分離培養(yǎng)，在無(wú)菌條件下按常規(guī)組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，4第3代或第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶消化80%融合的單層培養(yǎng)細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/ml，并接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μL。向96孔板中分別加入設(shè)定濃度的五倍子單寧酸、PGG和秋水仙堿。每個(gè)濃度3個(gè)孔，以不加藥物的培養(yǎng)物為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，同時(shí)每種藥物的每個(gè)濃度均設(shè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔。在37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT(Sigma)溶液(5 mg/ mL)10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μL的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在490 nm波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子管廠)上以各自的對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各孔光吸收值，計(jì)算細(xì)胞體外生長(zhǎng)的細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)。

1.4 細(xì)胞周期分析 用含0.02%EDTA 0.25%胰酶消化80%融合單層培養(yǎng)細(xì)胞。接種于25 mL培養(yǎng)瓶，細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/cm2。同時(shí)加入設(shè)定濃度的藥物樣品，培養(yǎng)48 h后收集1×106個(gè)以上細(xì)胞，冷PBS洗滌后，75%乙醇固定，PBS洗后加入1 mL PI溶液用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)測(cè)定。

1.5 凋亡細(xì)胞的姬姆薩染色 在含藥物樣品的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h的細(xì)胞和不加藥對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗后調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)細(xì)胞/mL，取100μL細(xì)胞懸液均勻涂布于載玻片上，干后用甲醇固定10 min，晾干。在細(xì)胞上滴加姬姆薩染色工作液，室溫染色10 min。洗去染液，室溫晾干24 h，樹脂封片。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng) 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PGG對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 我們分別測(cè)定了PGG和單寧酸對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞、增殖性瘢痕成纖維細(xì)胞、結(jié)締組織痣成纖維細(xì)胞和正常人皮膚成纖維細(xì)胞的體外增殖的影響。發(fā)現(xiàn)PGG和單寧酸對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性，對(duì)正常成纖維細(xì)胞的抑制作用最小(圖1a，1b，1c)。

圖1 a:PGG對(duì)不同組織來(lái)源成纖維細(xì)胞增殖抑制；b:單寧酸對(duì)不同組織來(lái)源成纖維細(xì)胞增殖抑制；c:10μg/mL PGG對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2 PGG對(duì)HaCat細(xì)胞增殖的影響 PGG和單寧酸對(duì)HaCat細(xì)胞的增殖呈雙相作用，PGG在低于5μg/ mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)為促進(jìn)作用，高于5μg/m L時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)為抑制作用。單寧酸對(duì)HaCat細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用強(qiáng)于PGG，在低于20μg/m L時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)為促進(jìn)作用，高于20μg/m L時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)為抑制作用，而秋水仙堿在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)濃度對(duì)HaCat細(xì)胞的生長(zhǎng)均為抑制作用(圖2)。

2.3 PGG對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用 PGG對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，20μg/mL作用48 h即達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)有效抑制濃度。而在相同濃度下對(duì)肝癌BEL7402細(xì)胞無(wú)抑制作用。單寧酸和秋水仙堿在這一濃度下對(duì)A375細(xì)胞的作用明顯低于PGG(圖3)。

圖2 不同藥物對(duì)HaCat細(xì)胞體外增殖的影響

2.4 PGG可使細(xì)胞周期發(fā)生改變 PGG可使瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和A375細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生顯著改變，減少G0～G1細(xì)胞，顯著增加S期細(xì)胞，使G2～M期細(xì)胞降為零。但對(duì)人肝癌BEL7402細(xì)胞幾乎無(wú)作用。單寧酸也可使細(xì)胞周期發(fā)生改變，但作用不及PGG。秋水仙堿可減少G0～G1期細(xì)胞，顯著增加S期細(xì)胞(表1)。

圖3 不同藥物對(duì)A375細(xì)胞體外增殖的影響

2.5 PGG可促進(jìn)細(xì)胞凋亡 PGG和秋水仙堿可顯著增加凋亡細(xì)胞的量，鏡下可見(jiàn)經(jīng)姬姆薩染色的細(xì)胞中，經(jīng)PGG作用的細(xì)胞，有大量胞核濃染、染色質(zhì)濃縮、核仁消失的細(xì)胞。經(jīng)秋水仙堿作用的細(xì)胞，細(xì)胞的胞核較大，核仁消失(表1，圖4a，4b，4c)。

表1 10μg/mL藥物樣品對(duì)細(xì)胞周期的作用

圖4 a:未加藥瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(×200)；b:10μg/mL PGG 48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(×200)；c:10μg/mL秋水仙堿48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(×200)

3 討論

目前，國(guó)際上對(duì)可水解單寧類中的多酚類化合物(包括單寧酸)的藥理活性研究主要有:促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，抗氧化作用，抗細(xì)胞突變和免疫調(diào)節(jié)作用。其中與目前瘢痕疙瘩防治策略相關(guān)的藥理學(xué)活性主要是促進(jìn)細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)的作用。單寧酸可以時(shí)間和劑量相依賴的方式抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)和增殖，這一作用主要是因?yàn)閱螌幩岬拇偌?xì)胞凋亡活性。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子中的單寧酸可以時(shí)間和劑量相依賴的方式抑制異常瘢痕成纖維細(xì)胞的體外增殖，抑制細(xì)胞分泌膠原蛋白。在同一實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)異常瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于正常對(duì)照細(xì)胞。在50μg/mL及其以下濃度時(shí)對(duì)正常人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，但對(duì)正常人皮膚黑素細(xì)胞的增殖有抑制作用。5，6五倍子單寧酸是一種混合物，包含有數(shù)種基本結(jié)構(gòu)相近的化合物，這些化合物在分子量、結(jié)構(gòu)和含量方面不同，使它們的生物活性產(chǎn)生差異。其中，五－間雙棓酰－葡萄糖[penta－(m－digalloyl)－glucose]是五倍子單寧酸的代表性結(jié)構(gòu)。其分子結(jié)構(gòu)中含有縮酚酸類酯鍵(depside bond)，結(jié)構(gòu)相對(duì)不太穩(wěn)定，可水解為PGG和沒(méi)食子酸甲酯及沒(méi)食子酸。PGG分子結(jié)構(gòu)中有5個(gè)相同的由核心葡萄糖上的羥基與沒(méi)食子酸上的羧基縮合成的酯鍵(aliphatic ester bond)，不含有縮酚酸類酯鍵，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，相對(duì)不易水解，分子量為940，是單寧酸中的主要活性物質(zhì)。

秋水仙堿在臨床上可用于瘢痕疙瘩的輔助治療。它通過(guò)解聚微管，抑制成纖維細(xì)胞增殖，提高膠原酶活性來(lái)干擾膠原合成。Blazek等建立的瘢痕疙瘩無(wú)胸腺小鼠模型證實(shí)了秋水仙堿的治療作用。7，8在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)秋水仙堿對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用。5，6

成纖維細(xì)胞、HaCat細(xì)胞、黑素瘤A375細(xì)胞和人肝癌BEL－7402細(xì)胞分別來(lái)源于中胚層、外胚層、外胚層神經(jīng)嵴和內(nèi)胚層，有不同的生物學(xué)行為。這些不同來(lái)源的細(xì)胞在增殖和凋亡方面對(duì)藥物反應(yīng)的異同可比較藥物作用的特異性，同時(shí)推測(cè)其毒副作用。本研究中發(fā)現(xiàn)PGG對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和黑素瘤A375細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，并且對(duì)成纖維細(xì)胞的作用呈時(shí)間和劑量依賴性；對(duì)HaCat細(xì)胞的增殖呈雙相作用，低濃度為促進(jìn)作用，高濃度為抑制作用；可使增殖受抑制細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變，表現(xiàn)為S期阻滯；凋亡細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞呈現(xiàn)胞核濃染、染色質(zhì)濃縮、核仁消失。說(shuō)明PGG不是一個(gè)廣譜的細(xì)胞毒性物質(zhì)，它對(duì)細(xì)胞的作用具有選擇性。特別是它對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的抑制增殖促進(jìn)凋亡的作用。而秋水仙堿對(duì)成纖維細(xì)胞、HaCat細(xì)胞、黑素瘤A375細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用。目前臨床上缺少一個(gè)明確的瘢痕疙瘩的優(yōu)化治療方案，缺乏安全有效的治療藥物。我們認(rèn)為PGG在治療瘢痕疙瘩方面是一個(gè)具有開發(fā)潛力的活性物質(zhì)。

1 Zhang J，Li L，Kim SH，et al.Anti－cancer，anti－diabetic and other pharmacologic and biological activities of penta－galloyl glucose.Pharm Res，2009，26(9):2066－2080.

2 Yi W，F(xiàn)ischer J，Krewer G，et al.Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis.JAgric Food Chem，2005，53(18):7320－7329.

3Huang HC，Lin CL，Lin JK.1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－β－D－glucose，quercetin，curcumin and lycopene induce cell－cycle arrest in MDA－MB－231 and BT474 cells through downregulation of Skp2 protein.JAgric Food Chem，2011，59(12):6765－6775.

4方富德.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧全書(上).1版.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998.77－78.

5沈丹蓓，夏隆慶，鞠強(qiáng)，等.五倍子等對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚瘢痕組織成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.中華皮膚科雜志，2002，35 (4):299－301.

6沈丹蓓，夏隆慶.五倍子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞體外增殖的影響.中華皮膚科雜志，2005，38(2):95－97.

7Blazek J，Ottomann C，Muehlberger T.Pharmacological therapy of keloids in an athymicmousemodel.Handchir Mikrochir Plast Chir，2008，40(2):81－87.

8 LawrenceWT.In search of the optimal treatment of keloids:report of a series and a review of the literature.Ann Plast Surg，1991，27(2):164－178.

(收稿:2013－04－10 修回:2013－07－28)

The effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of fibroblasts originated from keloid tissue

SHEN Dan-bei，JIANG Ming-jun.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing，210042

Objective:To determine the effect of pentagalloyl glucose on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts.Methods:The impact of pentagalloyl glucose，gallotannin and colchicine on the proliferation and apoptosis of keloid fibroblasts，HaCat cells and melanoma A375 cells was determined by cell growth test，cell cycle analysis and Giemsa stainmethod.Results:Pentagalloyl glucose had a relatively strong inhibitory effecton keloid fibroblasts andmelanoma A375's proliferation.It significantly inhibited fibroblast proliferation in a dose－and time－dependentmanner.Ithad dual roles on the proliferation of HaCat.Itenhanced the proliferation in low concentration and an inhibitory effect in high concentration.It inhibited the growth of dermal fibroblasts by interfering with cell cycle progression from S phase to G2/M phase.Cell Giemsa stain showed that there were increase in cells apoptosis.Conclusion:Pentagalloyl glucose can inhibit proliferation and enhance apoptosis of keloid fibroblasts.It can be a potential active substance in the treatment of keloid.

pentagalloyl glucose；proliferation；apoptosis

江蘇省自然科學(xué)基金(編號(hào):BK2011130)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042