敲低Txnip抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管細(xì)胞系凋亡

韋金英，史永紅，任韞卓，侯延娟，杜春陽(yáng)，張連珊，段惠軍

(河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，河北石家莊050017)

研究表明，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的一個(gè)主要機(jī)制。高血糖引起的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生對(duì)DN 的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用［1］，ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［2］。以往的研究顯示硫氧化蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，Txnip)參與了高糖(high glucose，HG)誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡［3］。前期實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)敲低Txnip表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞凋亡是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的，且與P38MAPK 信號(hào)的活化密切相關(guān)［4］。Txnip 可能在氧化應(yīng)激造成腎損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，減少糖尿病腎臟Txnip 的水平可能成為治療糖尿病腎損傷的有效靶點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察Txnip 與高糖狀態(tài)下腎小管細(xì)胞凋亡的關(guān)系以及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管細(xì)胞HK-2(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)。兔抗Txnip、cleaved caspase-3、P38 MAPK、P-P38 MAPK(Cell signaling 公司)。小鼠抗BAX 單克隆抗體(P-19)，兔抗BCL-2、caspase-3 和細(xì)胞色素c 多克隆抗體以及pro-light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(Tingen biotech 公司)。TUNEL 試劑盒(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組刺激實(shí)驗(yàn):常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待HK-2 細(xì)胞達(dá)75% ～85%匯合后，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步24 h。分成4 組:正常糖組(5.6 mmol/L 葡萄糖，NG);高糖組(30 mmol/L 葡萄糖，HG)，高糖+質(zhì)粒載體對(duì)照組(control shRNA Plasmid，HG+C)，高糖+VDUP1 shRNA Plasmid 組(HG +shRNA)。于刺激48 h 后收集細(xì)胞觀察。

1.2.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP 缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:細(xì)胞接種于8 孔Lab-Tek? 腔室玻片上，分組刺激48 h。DeadEndTM熒光TUNEL 系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.3 Western 印跡檢測(cè):加入細(xì)胞裂解液，冰浴2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，Lowry 法測(cè)定上清液蛋白濃度。按照Huang 等［5］所述方法分離線粒體和不含線粒體的胞質(zhì)蛋白，本次實(shí)驗(yàn)使用不含線粒體胞質(zhì)蛋白。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜;質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05 的脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，分別加入caspase-3、cleaved caspase-3、P38 MAPK、P-P38 MAPK、BAX、BCL-2 以及細(xì)胞色素c 抗體，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h;洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY 遠(yuǎn)紅外雙色熒光成像系統(tǒng)顯影(LI．COR Gene Company，USA 奧德賽公司)。用美國(guó)UVP 公司LabWorks 4.5 分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western 條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)Txnip、BAX 和BCL-2 表達(dá)變化:Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用20 μL 反應(yīng)體系，

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)10 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物(終濃度為1 ng/mL)各0.8 μL，雙蒸水6 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃30 s →95 ℃5 s→55 ℃30 s→72 ℃30 s 共40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)比較法計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)量，采用公式2－ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。引物序列(表1)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR and Real-time PCR analysis

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS:使用熒光探針5-(6)-羧基-2，7-二氯熒光素(CM-DCHFDA，Invitrogen)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量。HK-2 分組刺激48 h，最后加入含10 umol/L DCHF-DA 的染液，37°C 避光孵育30 min，PBS 洗滌，胰蛋白酶消化，懸浮于PBS 中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 敲低Txnip 對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮Txnip的影響

與NG 組相比，HK-2 細(xì)胞Txnip 顯著增加(P＜0.01);與HG 組相比，敲低Txnip 能夠顯著減少高糖誘導(dǎo)的Txnip 表達(dá)(P＜0.05)(表2)。

2.2 敲低Txnip 對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

與NG 組相比，在高糖刺激48 h，HK-2 凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.01);與HG 組相比，敲低Txnip能夠顯著減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)(P＜0.05)(圖1)。

表2 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞Txnip蛋白表達(dá)及Txnip mRNA 的影響Table 2 Effect of Txnip interference on Txnip in HK-2(n=6)

2.3 敲低Txnip 對(duì)高糖誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)影響

與NG 組相比，HG 糖組cleaved caspase-3 表達(dá)和BAX/BCL-2 比率顯著增加(P＜0.01);敲低Txnip能夠顯著抑制HG 誘導(dǎo)的cleaved caspase-3 表達(dá)和BAX/BCL-2 比率(P＜0.05)(圖2，表3)。

2.4 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小管上皮線粒體細(xì)胞色素c 釋放的影響

與正常糖對(duì)照組相比，高糖組胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c 水平明顯增加(P＜0.01);與高糖組相比，Txnip敲低組細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素c 水平明顯降低(P＜0.05)(圖3)。質(zhì)粒載體對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，胞質(zhì)中細(xì)胞色素c 水平無(wú)明顯差異。

圖1 原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Effect of Txnip interference on HG-induced apoptosis of HK-2 is analyzed by TUNEL(n=6)(×200)

圖2 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞cleaved caspase-3、BAX 和BCL-2 蛋白表達(dá)影響Fig 2 Effect of Txnip interference on activation of caspase-3 and expression of BAX and BCL-2 in HK-2(n=6)

表3 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞BCL-2 mRNA、BAX mRNA 表達(dá)的影響Table 3 Effect of Txnip interference on BCL-2 and BAX mRNA in HK-2(n=6)

圖3 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C 釋放的影響Fig 3 Effect of Txnip interference on the release of cytochrome c from mitochondria to cytoplasm in HK-2(n=6)

2.5 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

與正常糖對(duì)照組相比，高糖組HK-2 細(xì)胞ROS產(chǎn)生顯著升高(P＜0.01);Txnip 敲低組細(xì)胞ROS表達(dá)明顯低于高糖組(P＜0.05)(圖4)。質(zhì)粒載體對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，ROS 水平無(wú)明顯差別。

2.6 敲低Txnip 對(duì)HG 誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞P38 MAPK 激活的影響

與NG 組相比，HG 組P38 MAPK 的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);與高糖組相比，Txnip 敲低組P38 MAPK 磷酸化水平明顯降低(P＜0.05)(圖5)。

3 討論

既往研究提示ROS 對(duì)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)起著調(diào)節(jié)作用，ROS 的過量生成導(dǎo)致了氧化應(yīng)激、細(xì)胞功能喪失及細(xì)胞凋亡。在糖尿病時(shí)，腎臟存在大量ROS 的蓄積，破壞了腎臟組織內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，造成腎組織氧化應(yīng)激狀態(tài)，參與腎損傷發(fā)生與發(fā)展。最近研究顯示高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致腎臟近端小管細(xì)胞線粒體超氧化物生成增多，因此，調(diào)節(jié)糖尿病腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)有可能成為有效的治療糖尿病腎病的靶點(diǎn)。Txnip 又稱維生素D3 上調(diào)蛋白1(VDUP-1)或Trx結(jié)合蛋白2(TBP-2)，能夠與Trx 的活性位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基結(jié)合而抑制其活性，改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。Txnip 缺乏腎小球系膜細(xì)胞阻斷高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是通過影響TCA循環(huán)與糖酵解葡萄糖流量控制ROS 產(chǎn)生［6］。最近研究也證實(shí)，抗氧化劑tempol 以及敲低Txnip 表達(dá)均能夠抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡［4］。本研究結(jié)果顯示，敲低Txnip 能夠抑制HG 誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡增加，cleaved caspase-3 表達(dá)和BAX/BCL-2 比率升高以及促使細(xì)胞色素c 從線粒體釋放入胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，敲低Txnip 抑制HG 誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞凋亡可能是通過減少ROS 和保護(hù)線粒體功能實(shí)現(xiàn)的。以上提示，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡和ROS 產(chǎn)生密切相關(guān)。

P38 蛋白激酶為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是一個(gè)重要的信號(hào)分子。研究表明，P38 MAPK 信號(hào)通路可能與DN 有關(guān)［7－9］。前期研究也表明，采用SB203580 阻斷P38 MAPK 通路能夠明顯抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡，cleaved caspase-3 表達(dá)和BAX/BCL-2 比率［4］。以上說明，P38 MAPK 信號(hào)通路可能與HK-2 細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，敲低Txnip 能夠顯著抑制HG 誘導(dǎo)的P38 MAPK的活化，提示敲低Txnip 抑制HG 誘導(dǎo)的HK-2 凋亡可能部分是通過調(diào)節(jié)P38 MAPK 通路活化實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，敲低Txnip 能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2 的凋亡，這種作用可能是通過減少ROS 產(chǎn)生，保護(hù)線粒體功能以及抑制P38MAPK 信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的。因此，推測(cè)Txnip 可能是一個(gè)潛在的糖尿病腎病治療靶點(diǎn)。

［1］Devi TS，Hosoya K，Terasaki T，et al．Critical role of TXNIP in oxidative stress，DNA damage and retinal pericyte apoptosis under high glucose:implications for diabetic retinopathy［J］．Exp Cell Res，2013，319:1001－1012．

［2］Kanwar YS，Wada J，Sun L，et al．Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression［J］．Exp Biol Med(Maywood)，2008，233:4－11．

［3］Chen J，Saxena G，Mungrue IN，et al．Thioredoxin-interacting protein:a critical link between glucose toxicity and beta-cell apoptosis［J］．Diabetes，2008，57:938－944．

［4］Shi Y，Ren Y，Zhao L，et al．Knockdown of thioredoxin interacting protein attenuates high glucose-induced apoptosis and activation of ASK1 in mouse mesangial cells［J］．FEBS Lett，2011，585:1789－1795．

［5］Huang JS，Chuang LY，Guh JY，et al．Antioxidants attenuate high glucose-induced hypertrophic growth in renal tubular epithelial cells［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2007，293:1072－1082．

［6］Shah A，Xia L，Goldberg H，et al．Thioredoxin-interacting protein mediates high glucose-induced reactive oxygen species generation by mitochondria and the NADPH oxidase，Nox4，in mesangia cells［J］．J Biol Chem，2013，288:6835－6848．

［7］Fang Y，Tian X，Bai S，et al．Autologous transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorates streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats by inhibiting oxidative stress，pro-inflammatory cytokines and the P38 MAPK signaling pathway［J］．Int J Mol Med，2012，30:85－92．

［8］Lv ZM，Wang Q，Wan Q，et al．The role of the P38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells［J］．PLoS One，2011，6:e22806．doi:10．

［9］王臻，陸利民．糖代謝紊亂致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制進(jìn)展［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32:1360－1363．