心肌缺血對大鼠孤束核利鈉肽受體表達的影響

牛麗靜，白 云，管振龍，宋俊貞，苗智慧，夏曉紅，王燕凌，王惠娟

(1.河北省疾病預防控制中心醫(yī)學研究所，河北石家莊050021;2.唐山職業(yè)技術學院基礎醫(yī)學部解剖教研室，河北唐山063000;3.河北師范大學生命科學學院神經生理學教研室，河北石家莊050024;4.河北省血液中心臨床輸血技術指導辦公室，河北石家莊050071)

利鈉肽主要通過激活NPR-A(natriuretic peptide receptors A)或NPR-B(natriuretic peptide receptors B)受體，完成利尿、降壓、調節(jié)神經、促進骨骼發(fā)育等功能，特別在調控心腎功能以維持機體穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用［1］。另一種受體NPR-C(natriuretic peptide receptors C)，被認為是可以從循環(huán)中清除利鈉肽的受體。利鈉肽受體廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)中，特別在下丘腦、腦干及室周器官有密集表達，在中樞調控心血管穩(wěn)態(tài)過程中亦起著重要的作用［2-4］。孤束核是接受并整合心血管傳入沖動的初級中樞，其內的膽堿能和兒茶酚胺能神經元參與了血壓調節(jié)［5］?，F(xiàn)已知孤束核內存在有NPR-A 和NPR-C 陽性神經元，但這些神經元是否為膽堿能或兒茶酚胺能神經元?在心肌缺血后，孤束核區(qū)域的NPR-A、NPR-C 的表達量是否隨之發(fā)生變化?這些均未見報道。本研究擬通過檢測NPR-A 和NPR-C 的表達變化和NPR-A/TH(或NPR-C/TH)、NPR-A/ChAT(或NPR-C/ChAT)的雙標記情況，來探討心肌缺血后利鈉肽在孤束核內的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

清潔級3月齡雄性SD 大鼠(體質量280 ～330 g，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證編號:1006015)63 只。兔抗NPR-A 多克隆抗體和兔抗NPR-C 多克隆抗體(Abcom)、山羊抗ChAT 單克隆抗體(Millpore 公司)、小鼠抗TH 單克隆抗體(Sigma公司)、山羊抗小鼠IgG-FITC 和兔抗山羊IgG-FITC(均中杉金橋有限公司)。

1.2 實驗分組及模型復制

大鼠隨機分為免疫熒光化學組(3 只)，實驗組(模型組，43 只)，實驗對照組(假手術組，sham，8只)、對照組(control，9 只)。

免疫熒光化學反應組大鼠經4%多聚甲醛灌流固定，取腦組織行冰凍切片，免疫化學熒光反應。給實驗組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，復制心肌缺血動物模型［6］。大鼠手術后進行恢復性飼養(yǎng)。將成活的實驗組大鼠隨機分為3 d 取材組(9 只)，術后7 d 取材組(7 只)，術后14 d 取材組(9 只)，術后18 d 取材組(9 只)和術后28 d 取材組(9 只)。實驗對照組大鼠除了不結扎冠狀動脈左前降支外，其他手術與實驗組的處理相同。對照組大鼠不做手術處理，正常飼養(yǎng)。

1.3 TTC 染色

從實驗組、假手術組和對照組取材過程中摘下的心臟的心尖部注入1 mL 3%伊萬氏藍。數(shù)秒后將心臟在4 ℃0.9%氯化鈉注射液中沖洗，濾紙吸干水后－20 ℃保存30 min。隨后把冷凍后的心臟沿房室溝軸橫切成2.0 ～2.5 mm 厚的斷面，用0.1%TTC 0.9%氯化鈉注射液溶液37 ℃孵育30 min。正常組織被染成藍色，缺血心肌組織被染成紅色，梗死區(qū)不著色，以此判定心肌缺血模型是否復制成功［7］。

1.4 蛋白質印跡實驗腦組織取材

實驗組動物分別在手術后的第3、7、14、18 和28 天深度麻醉(80 mg/kg)，剪開胸腔，暴露心臟，經升主動脈插管，先用100 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液。血液沖洗干凈后，迅速摘下心臟，用吸水紙吸干多余水分后稱重;取整腦，在閂平面取孤束核組織(約0.015 g)。將取下的腦組織置于低溫環(huán)境(0 ～4 ℃)備用。實驗對照組大鼠、對照組大鼠于實驗組術后3 d 按上述方法進行取材處理。

1.5 免疫熒光化學反應

所有切片均采用漂浮染色法:冰凍切片放入漂洗盒，PBS 換洗3 次，然后加入4%牛血清(含0.3%Triton 的PBS 稀釋)室溫封閉40 min;PBS 換洗3次，加入小鼠抗TH 抗體(1∶10 000)/山羊抗ChAT(1∶1 000)、兔抗NPR-A 抗體(1∶600)/兔抗NPR-C(1∶1 600)(用含0.3% Triton 的PBS 稀釋)混合液，振蕩后4 ℃冰箱中孵育72 h;取出后PBS 換洗5 次;加入山羊抗小鼠IgG-FITC(1∶500，用含0.3% Triton的PBS 稀釋)、山羊抗兔IgG-TRITC(1∶1 000，用含0.3% Triton 的PBS 稀釋)混合液，室溫下振蕩孵育4 h;PBS 換洗5 次，切片裱于掛有3%明膠的載玻片上，置于陰涼處避光晾干后，甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察并照相，記錄結果。

1.6 蛋白質印跡分析

分別將實驗組、實驗對照組以及對照組大鼠取下的孤束核組織進行處理。低溫下加入RIPA 裂解液研磨成漿液，離心后取上清液，考馬斯亮藍蛋白定量。按照蛋白標準曲線測定組織上清液中的蛋白含量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(每加樣孔中蛋白上樣量60 μg)之后，將凝膠進行轉膜，并進行NPR-A 和NPR-C 的印跡雜交(抗體稀釋濃度為1∶500)以內參肌動蛋白(β-actin)條帶吸光度值作為標準，計算NPR-A 和NPR-C 蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學分析

用Image J 圖像分析軟件采集吸光度值，并以SPSS13.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗結果以算術平均數(shù)±標準差(±s)表示，進行單因素方差分析，Student Newman-Keuls 檢驗。

2 結果

2.1 TTC 染色的結果

動物心臟呈現(xiàn)深藍色，在冠脈結扎創(chuàng)口附近可見明顯的紅色缺血區(qū)和白色梗死區(qū)(圖1)。假手術組動物心肌可見少量紅色區(qū)域。空白對照組動物心臟未見紅色缺血區(qū)及白色梗死區(qū)域。提示所有大鼠心肌缺血模型復制成功。

圖1 TTC 染色結果及大鼠心臟圖片F(xiàn)ig 1 Photographs of the heart sections after TTC staining and hearts of coronary artery ligation group and sham group(n=6)

2.2 心肌缺血后大鼠心臟的變化

隨心肌缺血時間的延長大鼠心臟明顯肥大，心臟重量也有升高的趨勢，并在術后14、18 和28 d 比對照組及假手術組有極顯著的增加。

2.3 孤束核周區(qū)Western blot 的結果

NPR-A 在相對分子質量118 ku 處有明顯陽性條帶，NPR-C 在相對分子質量65 ku 處有明顯的陽性條帶(圖2)。心肌梗死后NPR-A 在孤束核周區(qū)的表達呈現(xiàn)一定的波動性，術后3、7 d 模型組與對照組無顯著性差異，但有逐漸升高的趨勢，在術后14 d 顯著低于對照組(P＜0.05)，約為其蛋白表達量的1/2，術后14、18、28 d，NPR-A 的表達亦呈逐漸升高的趨勢，至術后28 d 顯著高于對照組(P＜0.01)，約為其蛋白表達量的2.4 倍。心肌梗死后NPR-C 在孤束核周區(qū)的表達均低于對照組，3、7、14和18 d 有顯著性差異(P＜0.01)。

2.4 免疫熒光染色的結果

熒光顯微鏡下，可見孤束核內有密集的FITC 標記的綠色TH 陽性神經元(圖3A、4A)，其中以中小型為主;以及密集的TRITC 標記紅色NPR-A 神經膠質細胞和少量的神經元(圖3B)。孤束核中TH/NPR-A 雙標記神經元呈黃色，有少量散在分布(圖3C)。孤束核內還存在有TRITC 標記的紅色NPR-C 神經元和大量神經膠質細胞(圖4B)。TH/NPR-C 雙標記神經元呈黃色，在孤束核中有密集分布(圖4C)。

圖2 冠脈結扎后大鼠孤束核周區(qū)NPR-A 和NPR-C 的表達變化Fig 2 NPR-A，NPR-C expression in the nucleus of the solitary tract of the rats after coronary artery ligation

在ChAT 與NPR-A/NPR-C 的雙標記熒光化學實驗中，未發(fā)現(xiàn)有雙標記神經元或神經膠質細胞分布于孤束核群內。

3 討論

心肌缺血后，心室肌和心房肌細胞增加分泌的利鈉肽與心肌病變的程度呈正相關［8］?；A實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死模型大鼠的血漿腦鈉肽濃度在第3 天和第14 天有兩次升高［9］。血液中升高的利鈉肽一方面通過抑制腎上腺醛固酮的分泌、降低腎小管細胞的代謝活動、促進排鈉排水，降低血壓和回心血量;另一方面，利鈉肽可通過無血-腦脊液屏障的部位入腦，作用于不同中樞部位，通過影響激素的分泌和交感、副交感神經的活動調節(jié)心血管的功能。有研究證實，心肌缺血后的心肌組織內，心房肽和腦鈉肽的表達均顯著升高，其受體NPR-C 的表達也隨之增多，但于缺血后的第28 天在腎臟和肺內顯著降低［10］。本研究結果孤束核區(qū)域內NPR-A 由低到高的表達變化，表明病理條件下利鈉肽在孤束核區(qū)域的調節(jié)功能，可能主要是通過NPR-A 表達變化實現(xiàn)的。NPR-A 表達的增加可以提高利鈉肽對中樞的作用。本小組以往的研究顯示，心肌缺血后延髓腹側部NPR-A 的表達顯著升高，與心肌缺血后血液中利鈉肽含量變化的時間點和趨勢一致［11］。提示從無血-腦脊液屏障區(qū)進入中樞的利鈉肽可能先作用于延髓腹側部升壓區(qū)，適應性的升高交感緊張性，增強心肌收縮力，加快心率。孤束核區(qū)域缺血14 d 至缺血28 d NPR-A 表達的增加，可能與缺血后期激活此處的神經元來抑制升壓區(qū)的交感興奮相關。NPR-A 蛋白在心肌缺血后孤束核與延髓腹側部表達的差異，可能與這些區(qū)域在心血管調控中的作用不同相適應。

圖3 TH 陽性神經元與NPR-A 陽性神經元在腦干內的分布Fig 3 Double immunofluorescence for TH and NPR-A positive neurons in brainstem (×100)

圖4 TH 陽性神經元與NPR-C 陽性神經元在腦干內的分布Fig 4 Double immunofluorescence for TH and NPR-C positive neurons in brainstem (×100)

孤束核是壓力反射的第一級中樞，接受動脈壓力感受器投射，并對這些信息進行整合后投射到延髓吻段腹外側區(qū)和延髓尾段腹外側區(qū)，維持血壓的相對穩(wěn)定。兒茶酚胺可以直接調控到孤束核的內臟初級傳入［12］;而膽堿能神經元則直接參與了壓力感受器反射過程［5］。本實驗的結果顯示，在孤束核內僅有少量、散在的NPR-A/TH 雙標記神經元，而有較多的NPR-C/TH 雙標記神經元;但未見NPR-A/ChAT 或NPR-C/ChAT 雙標記神經元。這提示，心肌缺血后分泌增加的利鈉肽在孤束核區(qū)域對心血管反射的調節(jié)，可能不是直接通過影響膽堿能和兒茶酚胺能神經元的活動實現(xiàn)的，其具體的生理機制尚需進一步研究。

［1］Chopra S，Cherian D，Verghese PP，et al．Physiology and clinical significance of natriuretic hormones［J］．Indian J Endocrinol Metab，2013，17:83-90．

［2］Marei HE．Fine structural and immunohistochemical localization of cardiac hormones (ANP)in the right atrium and hypothalamus of the white rat［J］．Eur J Morphol，2002，40:37-41．

［3］Tsukada T，Nobata S，Hyodo S，et al．Area postrema，a brain circumventricular organ，is the site of antidipsogenic action of circulating atrial natriuretic peptide in eels［J］．J Exp Biol，2007，210:3970-3978．

［4］Abdelalim EM，Osman AH，Takada T，et al．Immunohistochemical mapping of natriuretic peptide receptor-A in the brainstem of Macaca fascicularis［J］．Neurosci，2007，145:1087-1096．

［5］Vieira AA，De Luca LA Jr，Colombari E，et al．Commissural NTS lesions enhance the pressor response to central cholinergic and adrenergic activation［J］．Neurosci Lett，2012，521:31-36．

［6］吳雪梅，王琛，謝紅，等．NF-кB 參與七氟烷預處理所致延遲性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷［J］．基礎醫(yī)學與臨床，2013，33:39-43．

［7］Izumi T，Saito Y，Kishimoto I，et al．Blockade of the natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase-A inhibits NF-kappaB activation and alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury［J］．J Clin Invest，2001，108:203-213．

［8］劉紅櫻，王蔚，葛均波．B 型利鈉肽與急性冠狀動脈綜合征的研究進展［J］．上海醫(yī)學，2011，34:237-239．

［9］Sawada Y，Inoue M，Kanda T，et al．Co-elevation of brain natriuretic peptide and proprotein-processing endoprotease furin after myocardial infarction in rats［J］．FEBS Lett，1997，400:177-182．

［10］Hystad ME，Oie E，Grogaard HK，et al．Gene expression of natriuretic peptides and their receptors type-A and-C after myocardial infarction in rats［J］．Scand J Clin Lab Invest，2001，61:139-150．

［11］牛麗靜，白云，苗智慧，等．心肌缺血對大鼠延髓利鈉肽受體表達的影響［J］．中國病理生理雜志，2014，30:220-225．

［12］郭峰，馬文領，張文斌，等．孤束核內兒茶酚胺能神經元匯聚內臟傳入與口面部軀體傷害性信息并向臂旁核投射［J］．神經解剖學雜志，2006，22:173-177．