環(huán)孢素A改善創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管及器官功能

雷 艷，董兆君

(第三軍醫(yī)大學(xué)1.衛(wèi)勤訓(xùn)練基地醫(yī)學(xué)綜合教研室;2.軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶400038)

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是線粒體膜上的重要的通道結(jié)構(gòu)，在缺血缺氧和再灌注引起的器官功能損害中有重要作用［1－2］。環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)是目前發(fā)現(xiàn)的特異性MPTP 關(guān)閉劑，能夠通過抑制MPTP 開放發(fā)揮對(duì)缺血再灌注心臟的保護(hù)作用［3］。筆者曾發(fā)現(xiàn)，CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克動(dòng)物有較好的治療作用，能有效改善休克后的酸中毒狀態(tài)［4］。嚴(yán)重創(chuàng)傷休克后血管功能障礙是影響休克患者組織灌注不足和隨后發(fā)生的器官功能障礙的關(guān)鍵因素［5－6］。但CsA 能否改善休克后血管功能，改善組織灌注，發(fā)揮對(duì)器官功能的保護(hù)作用，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型，觀察不同劑量CsA 對(duì)休克動(dòng)物血管收縮/舒張功能的影響，同時(shí)觀察CsA 對(duì)肝、腎重要器官血流量、肝腎功能及線粒體功能的影響，以探討CsA發(fā)揮對(duì)休克動(dòng)物保護(hù)作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD 大鼠48 只，體質(zhì)量180 ～220 g，雌雄各半［第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(渝)2007-0005］。CsA、二磷酸腺苷(ADP)、乙酰膽堿(Sigma 公司)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒、血尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒、血肌酐(CREA)檢測(cè)試劑盒(Bechman 公司)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

復(fù)制創(chuàng)傷失血性休克模型［6］:大鼠右側(cè)股動(dòng)脈及股靜脈插管，通過股動(dòng)脈插管放血使血壓降至40 mmHg，并維持3 h，折斷左側(cè)股骨。大鼠隨機(jī)分為6 組(n =8):對(duì)照組、休克組、乳酸林格氏液(LR)復(fù)蘇組、CsA 1、5 和10 mg/kg 組。休克模型完成后按照分組進(jìn)行復(fù)蘇:LR 組給予2 倍失血量的LR 輸注，CsA 組在LR 中加入不同劑量的CsA 輸注;休克組在休克模型完畢后不復(fù)蘇;對(duì)照組僅插管、不放血、不復(fù)蘇。在復(fù)蘇后2 h，檢測(cè)各項(xiàng)功能指標(biāo)。

1.3 肝/腎血流量和肝/腎功能檢測(cè)

將大鼠行剖腹手術(shù)，通過激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀(PeriFlux System 5000)測(cè)定肝/腎的血流量［7］。從股動(dòng)脈抽血，用全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定肝腎功能，包括AST、ALT、BUN 和CREA［7］。

1.4 血管收縮/舒張反應(yīng)性測(cè)定

采用離體血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)［6］，記錄血管在梯度濃度去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，1×10－9、1×10－8、1×10－7、1 ×10－6和1 ×10－5mol/L)下的收縮力(收縮反應(yīng)性用NE 誘導(dǎo)血管收縮力與124 mmol/L的高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮力的百分比表示)［8］。隨后記錄血管對(duì)不同濃度的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，1 ×10－9、1 ×10－8、1 ×10－7、1 ×10－6和1 ×10－5mol/L)的舒張反應(yīng)性(以加入ACh 后血管環(huán)收縮力減少的百分比反映)。

1.5 線粒體功能檢測(cè)

提取肝、腎和小腸的線粒體，通過溶氧儀(MT 200)測(cè)定在有ADP 刺激下(3 態(tài)呼吸)和無ADP 刺激下(4 態(tài)呼吸)的氧氣消耗量，以呼吸控制率(RCR，即3 態(tài)呼吸耗氧率和4 態(tài)呼吸耗氧率的比值)來反映線粒體功能［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管收縮/舒張功能的影響

休克后大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE 誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)明顯降低(P＜0.01)。LR 組大鼠的血管收縮功能有輕度回升，但仍顯著低于對(duì)照組。CsA 輸注可使休克大鼠血管收縮功能明顯恢復(fù)，其中CsA 5 和10 mg/kg 組血管最大收縮反應(yīng)明顯高于LR 組(P＜0.01)(圖1)。CsA 也明顯恢復(fù)了休克后降低的血管舒張反應(yīng)性，CsA5 mg/kg 組血管最大舒張反應(yīng)性明顯高于LR 組(P＜0.05)(圖2)。

圖1 NE 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的量效曲線Fig 1 Effects of CsA on the concentration-response curve for NE(1 ×10 －9 ～1 ×10 －5 mol/L)in SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock(% of the contraction produced by 124 mmol/L K +，±s，n=8)

2.2 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官血流量的影響

與對(duì)照組相比，休克后大鼠肝及腎的血流量均顯著降低(P＜0.01)。5 mg/kg 和10 mg/kg 的CsA輸注可明顯恢復(fù)器官血流量，明顯高于LR 組(P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

2.3 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響

休克后肝、腎功能的重要指標(biāo)都明顯升高，包括AST、ALT、BUN 和CREA(P＜0.01)。與LR 組相比，CsA(1 和5 mg/kg)可明顯降低休克大鼠血漿中ALT 和CREA 的水平(P＜0.01，P＜0.05)。但LR和CsA 對(duì)AST 和BUN 無明顯影響(表2)。

圖2 ACh 誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)的量效曲線Fig 2 Effects of CsA on the concentration-response curve for ACh(1 ×10 －9 ～1 ×10 －5 mol/L)in SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock(±s，n=8)

表1 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官血流量的影響Table 1 Effects of CsA on blood flow in the liver and kidney after traumatic hemorrhagic shock(±s，U/min，n=8)

表1 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官血流量的影響Table 1 Effects of CsA on blood flow in the liver and kidney after traumatic hemorrhagic shock(±s，U/min，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with LR group．

groupliverkidney sham614 ±53302 ±29 shock356 ±58*67 ±15*LR328 ±65132 ±34 CsA 1 mg/kg413 ±47189 ±28#CsA 5 mg/kg444 ±50##224 ±48##CsA 10 mg/kg428 ±55#192 ±24#

2.4 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響

休克也使肝、腎、腸的線粒體功能明顯降低(P＜0.01)。LR 復(fù)蘇后各器官線粒體功能無明顯改改善。CsA 5 mg/kg 輸注能明顯改善各器官的線粒體功能，其作用明顯優(yōu)于單用LR 復(fù)蘇(P＜0.01)(表3)。

表2 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響Table 2 Effects of CsA on the liver and kidney function after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

表2 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響Table 2 Effects of CsA on the liver and kidney function after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.05，##P＜0.01compared with LR group．

groupAST(U/L)ALT(U/L)BUN(mmol/L)CREA(μmol/L)sham138 ±5833.2 ±5.16.7 ±0.826.7 ±3.7 shock424 ±59*71.6 ±9.6*13.2 ±1.3*72.6 ±9.3*LR411 ±6385.0 ±10.612.9 ±0.662.8 ±7.1 CsA 1 mg/kg454 ±9458.6 ±9.8##12.3 ±1.347.3 ±11.6#CsA 5 mg/kg405 ±7464.7 ±8.2##12.2 ±1.646.7 ±9.3#CsA 10 mg/kg513 ±4587.7 ±19.513.1 ±0.958.2 ±1 4.8

表3 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響Table 3 Effects of CsA on the mitochondrial function(RCR)in the liver，kidney and intestine after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

表3 CsA 對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響Table 3 Effects of CsA on the mitochondrial function(RCR)in the liver，kidney and intestine after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham-operated group;#P＜0.01 compared with LR group．

groupliverkidneyintestine sham6.58 ±1.195.61 ±0.927.38 ±1.34 shock3.45 ±0.91*3.51 ±0.73*3.73 ±0.38*LR3.39 ±0.593.13 ±0.854.20 ±0.86 CsA 1 mg/kg5.21 ±0.825.21 ±1.33#6.50 ±1.42#CsA 5 mg/kg6.11 ±1.23#5.40 ±0.60#6.70 ±1.21#CsA 10 mg/kg4.07 ±1.553.54 ±1.314.94 ±1.50

3 討論

血管低反應(yīng)性是嚴(yán)重創(chuàng)傷休克及膿毒癥等臨床重癥患者常出現(xiàn)的一種血管功能障礙，是導(dǎo)致嚴(yán)重器官功能損害甚至患者死亡的重要原因［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，MPTP 的關(guān)閉劑CsA 能明顯改善休克動(dòng)物的存活狀態(tài)，并糾正休克后的酸中毒狀態(tài)［4］。CsA 是一種免疫抑制劑，廣泛用于治療器官移植后的排斥反應(yīng)，近來研究發(fā)現(xiàn)它能有效地抑制MPTP的開放，對(duì)缺血再灌注后心、腦損傷有較好的保護(hù)作用［3］。但CsA 對(duì)休克后血管低反應(yīng)性的作用及其與器官功能的關(guān)系，目前尚少見報(bào)道。本研究顯示CsA 可明顯恢復(fù)休克后降低的血管收縮/舒張功能，其中5 mg/kg 的CsA 效果最為明顯。CsA 5 mg/kg對(duì)肝及腎組織血流量、肝腎功能和線粒體功能也有明顯改善作用。提示CsA 除了對(duì)缺血再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用，還可通過恢復(fù)休克后血管反應(yīng)性，改善重要器官的血流灌注，改善器官功能和線粒體功能，來發(fā)揮抗休克作用。

在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，CsA 10 mg/kg 也可改善休克血管功能和器官血流量，但對(duì)于肝腎功能及線粒體功能，其作用與單用LR 無明顯差異，提示CsA 劑量增加并未提高其治療作用。有研究顯示高劑量CsA 可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)［9］。因此，合適的CsA 使用劑量需更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。根據(jù)本結(jié)果，CsA 5 mg/kg 可能是合適的劑量。

以上結(jié)果顯示，CsA 對(duì)休克后血管的收縮和舒張功能都有明顯的恢復(fù)作用，并可提高組織器官的血流灌注，改善器官和線粒體功能，發(fā)揮對(duì)創(chuàng)傷休克的治療作用。但是，CsA 作為免疫抑制劑，用于治療休克等臨床重癥時(shí)，是否會(huì)影響患者的免疫功能，尚需進(jìn)一步研究。

［1］Assaly R，de Tassigny Ad，Paradis S，et al．Oxidative stress，mitochondrial permeability transition pore opening and cell death during hypoxia-reoxygenation in adult cardiomyocytes［J］．Eur J Pharmacol，2012，675:6－14．

［2］Schwarzkopf TM，Hagl S，Eckert GP，et al．Neuroprotection by bilobalide in ischemia:improvement of mitochondrial function［J］．Pharmazie，2013，68:584－589．

［3］Gill RS，Lee TF，Manouchehri N，et al．Postresuscitation cyclosporine treatment attenuates myocardial and cardiac mitochondrial injury in newborn piglets with asphyxia-reoxygenation［J］．Crit Care Med，2013，41:1069－1074．

［4］雷艷，董兆君．環(huán)孢素A 對(duì)大鼠缺血缺氧后酸堿平衡的調(diào)節(jié)作用［J］．局解手術(shù)學(xué)雜志，2013，22:374－376．

［5］楊光明，李濤，徐競(jìng)，等．ERK 和P38 MAPK 升高M(jìn)LC20 磷酸化調(diào)節(jié)大鼠平滑肌低氧反應(yīng)性［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:366－370．

［6］Yang GM，Li T，Xu J，et al．PKC plays an important mediated effect in arginine vasopressin induced restoration of vascular responsiveness and calcium sensitization following hemorrhagic shock in rats［J］．Eur J Pharmacol，2010，628:148－154．

［7］Li T，Lin X，Zhu Y，et al．Short-term，mild hypothermia can increase the beneficial effect of permissive hypotension on uncontrolled hemorrhagic shock in rats［J］．Anesthesiology，2012，116:1288－1298．

［8］Wirth A，Benyó Z，Lukasova M，et al．G12-G13-LARGmediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension［J］．Nat Med，2008，14:64－68．

［9］程根陽(yáng)，李建生，劉章鎖．羅格列酮抑制CsA 引起的大鼠肝細(xì)胞TGF-β1 和FIBRONECTIN 的表達(dá)［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29:198－200．