等電點沉淀結(jié)合凱氏定氮法測定市售純牛奶中酪蛋白的含量

孫雯，李宏梁，*，魏莉娟，曹吉利，譚源，惠笑

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.西安產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，陜西西安710065；3.西安東方乳業(yè)有限公司，陜西西安710028）

等電點沉淀結(jié)合凱氏定氮法測定市售純牛奶中酪蛋白的含量

孫雯1，李宏梁1，*，魏莉娟2，曹吉利3，譚源3，惠笑1

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.西安產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，陜西西安710065；3.西安東方乳業(yè)有限公司，陜西西安710028）

在酪蛋白測定方法的前期研究基礎(chǔ)上，對等電點沉淀法進行改進，結(jié)合凱氏定氮法對市售純牛奶中的乳蛋白組分進行了測定。確定了制備純品酪蛋白的最佳洗滌劑和洗滌次數(shù)，NaOH溶液堿復(fù)溶酪蛋白等電點沉淀物最佳添加范圍。實驗結(jié)果表明，改進后的等電點沉淀方法，測定酪蛋白質(zhì)量分數(shù)都在74%～76%。pH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液作為洗滌劑，對于體系pH的維持更加穩(wěn)定。僅沉淀的處理方式可以將大部分乳清蛋白和酪蛋白進行分離。NaOH溶液最佳添加范圍是25mL～35mL。改進后的等電點沉淀結(jié)合凱氏定氮法高效準確，簡單易行，重現(xiàn)性好，可以用于純牛奶中酪蛋白的摻假鑒定。

牛乳；摻假；堿復(fù)溶酪蛋白；等電點沉淀法；凱氏定氮法

近年來，我國乳品安全事件頻頻發(fā)生，最主要的問題是乳品摻假問題和抗生素殘留問題。而乳品摻假問題的間接原因是因為我國乳品安全國家標準的缺失——缺乏檢驗乳品摻假的正確指標和檢驗方法[1]。乳制品安全的核心是乳源蛋白質(zhì)的檢測，目前通用的蛋白質(zhì)檢測方法“凱氏定氮法”，即通過測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量。由于蛋白質(zhì)檢驗方法的缺陷和落后，因此添加乳清粉、食用明膠和三聚氰胺等可以增加牛奶蛋白質(zhì)的檢測指標，從而使摻假食品通過食品檢驗機構(gòu)的檢測[2]。隨著國家對乳品安全事件的關(guān)注，也出臺了相關(guān)政策和檢測方法，但這些檢測方法大多是專一性的，不具有廣泛性。為此，急需建立具有廣泛性、快速、準確的摻假檢測方法，以確保乳制品的質(zhì)量和安全。

牛奶中酪蛋白含量約為2.6 g/100mL，酪蛋白質(zhì)量分數(shù)一般穩(wěn)定在77%～78%，且對于同一品種的奶牛，很少受季節(jié)、飼料等的影響。因此，牛奶中酪蛋白含量可作為一個定性、定量的質(zhì)量指標，來判斷牛奶質(zhì)量優(yōu)劣和是否摻假[3]。

通過對國內(nèi)外酪蛋白測定方法[4-8]的研究比較，發(fā)現(xiàn)等電點沉淀法是一種常見的、簡單易行的乳品安全常規(guī)檢驗方法，但一方面該方法在操作步驟上，（1）需要經(jīng)過酸沉、離心、復(fù)雜的洗滌過程和長時間的干燥過程，才能得到純品酪蛋白沉淀；（2）烘干后樣品形狀很堅硬，只能通過稱量的方式測定酪蛋白含量，無法直接刮下來測定蛋白；（3）洗滌過程僅可以除去了大部分的水溶性雜質(zhì)和脂類物質(zhì)，所測得的純品酪蛋白干物質(zhì)中還含有很多雜質(zhì)沒有除去，其測定值會偏高。另一方面該檢測方法在實際應(yīng)用上未見同時對沉淀物與上清液含氮量測定的研究報道，即未見驗證酪蛋白和乳清蛋白相加得到的理論蛋白質(zhì)含量與實際測定的總蛋白質(zhì)含量是否存在較大誤差。針對操作缺陷，研究了洗滌次數(shù)對酪蛋白含量測定的影響，同時采取了NaOH溶液堿復(fù)溶酪蛋白等電點沉淀物的可行改進方法，有利于沉淀物的準確取樣；針對應(yīng)用缺陷，本研究同時測定了市售純牛奶中的酪蛋白、乳清蛋白和總蛋白，并對測定值進行了準確性誤差對比。

通過反復(fù)試驗對比，本實驗確定的純牛奶酪蛋白沉淀測定方法的技術(shù)路線是，準確吸取純牛奶樣品，采用等電點沉淀純牛奶，所得沉淀物用NaOH溶液堿復(fù)溶酪蛋白沉淀物，上清液用pH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液定容，用凱氏定氮法分別對純牛奶、酪蛋白和乳清蛋白進行測定，最終得到樣品中酪蛋白質(zhì)量分數(shù)，以此判斷乳品摻假行為。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

主要原料：227mL利樂枕銀橋純牛奶：西安銀橋生物科技有限責任公司生產(chǎn)，標簽標示的蛋白質(zhì)含量≥2.9 g/100 g。

主要試劑：10%乙酸溶液、pH 4.6醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、0.1mol/L氫氧化鈉溶液、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、400 g/L氫氧化鈉溶液、20 g/L硼酸溶液、0.094 7mol/L鹽酸標準滴定溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

BS323s電子天平（精確度0.001g）、PB-10酸度計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ES 35B-Pro磁力攪拌器；中佳牌高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Hanon半自動凱氏定氮儀、Hanon石墨消化儀：濟南海能儀器有限公司；大龍牌移液槍（5mL）：大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；天玻牌移液管（10mL）：天津市天科玻璃儀器制造有限公司；燒杯（100mL）；錐形瓶（250mL、300mL）；洗耳球；離心管（50mL）；容量瓶（100mL）；量筒（50mL）。

1.3 方法

1.3.1 等電點沉淀法的工藝改進

1.3.1.1 等電點沉淀法分離乳蛋白

準確吸取20mL奶樣于100mL燒杯中，燒杯置于磁力攪拌器上，攪拌同時用10%的乙酸溶液調(diào)節(jié)樣品的pH到4.60，然后將樣品轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，用5mL pH 4.6 HAc-NaAc緩沖溶液洗滌燒杯。將離心管放入離心機，5 000 r/min離心15min，將上清液倒入100mL容量瓶中，并記錄上清液體積。所得沉淀物用pH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液洗滌兩次，分別在上述條件下離心，倒出上清液于50mL離心管中。調(diào)節(jié)洗滌后上清溶液pH到4.60，5 000 r/min離心10min，分離合并3次上清液，用pH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液定容至100mL，得到乳清蛋白稀釋液。稱量沉淀物質(zhì)量后，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液復(fù)溶3個離心管中的沉淀物，混勻后合并，得到酪蛋白復(fù)溶溶液。酪蛋白復(fù)溶溶液和乳清蛋白稀釋液作為待測樣品，備用。

1.3.1.2 半自動凱氏定氮儀測定乳蛋白

向消化管中加入4.500 g催化劑（硫酸鉀∶硫酸銅=9∶1）。準確吸取酪蛋白復(fù)溶溶液2mL于消化管內(nèi)，記錄質(zhì)量，精確到0.1 g。加入10mL濃硫酸于消化管內(nèi)，在420℃消化1.5 h。靜置待消化管冷卻后，進行蒸餾，收集蒸餾液于加入30mL 2%硼酸溶液液的250mL的錐形瓶中。將蒸餾液全部移入300mL錐形瓶內(nèi)，蒸餾水洗滌，用0.094 7mol/L鹽酸標準滴定溶液進行滴定，記錄消耗鹽酸標準溶液的體積，酪蛋白含量參考公式（1）、（2）。其中純?nèi)榈牡牡獡Q算為蛋白質(zhì)的系數(shù)F為6.38。平行實驗，同時做試劑空白實驗。

準確吸取乳清蛋白稀釋液20mL于消化管內(nèi)，記錄質(zhì)量，用同樣的方法測定乳清蛋白含量。乳清蛋白含量參考公式（1）、（3）。其中純?nèi)榈牡牡獡Q算為蛋白質(zhì)的系數(shù)F為6.38。平行實驗，同時做試劑空白實驗。

準確吸取奶樣1mL于消化管內(nèi)，記錄質(zhì)量，用同樣的方法測定總蛋白含量?？偟鞍缀繀⒖脊剑?）。其中純?nèi)榈牡牡獡Q算為蛋白質(zhì)的系數(shù)F為6.38。平行實驗，同時做試劑空白實驗。

酪蛋白質(zhì)量分數(shù)參考公式（4）。

1.3.2 純品酪蛋白的制備條件的研究

1.3.2.1 洗滌劑的確定

洗滌劑采用蒸餾水和pH 4.6 HAc-NaAc緩沖溶液，對樣品在整個處理過程的pH進行監(jiān)測。

1.3.2.2 洗滌次數(shù)的確定

本研究采用“僅沉淀、洗滌1次、洗滌2次”3種不同的前處理方式，觀察上清液、調(diào)節(jié)上清pH后再沉淀和測定其乳蛋白含量。

1.3.3 酪蛋白沉淀復(fù)溶樣品的制備

分別向酪蛋白沉淀中加入10、15、20、25、30、35、40mL的0.1mol/LNaOH溶液，混勻后測定酪蛋白含量。

2結(jié)果與分析

2.1 等電點沉淀法的工藝改進

處理1實驗參數(shù)：3 000 r/min離心15min，蒸餾水作為洗滌劑，10mL 0.1mol/LNaOH溶液復(fù)溶。表1是處理1方式下，測定的純牛乳中乳蛋白含量。

表1 處理1測定純牛奶中乳蛋白含量Table1 M ilk protein content in pure milk determined by processing method 1

該處理方式的酪蛋白質(zhì)量分數(shù)都在61%以上，平均酪蛋白含量為2.02 g/100 g，乳清蛋白含量為1.15 g/100 g，酪蛋白質(zhì)量分數(shù)為63.02%，乳清蛋白質(zhì)量分數(shù)為35.83%。經(jīng)過前期研究，驗證了牛乳摻假檢驗的定性定量指標：酪蛋白質(zhì)量分數(shù)≥73%，所以該處理方式仍需改進。

分析發(fā)現(xiàn)，處理1中存在以下問題：（1）離心后，上清中總存在著沉淀顆粒，主要是由于酪蛋白膠粒的完全沉降需要足夠的速度和足夠的時間。（2）洗滌劑蒸餾水，會使得上清液中的pH發(fā)生變化，偏離酪蛋白的等電點，使部分酪蛋白沉淀復(fù)溶，隨上清液流失。（3）在復(fù)溶過程中，復(fù)溶效果不佳，一方面可能是NaOH添加量不足，另一方面是混勻方式不當，導(dǎo)致復(fù)溶后，溶液中存在著未完全復(fù)溶的酪蛋白沉淀顆粒。

根據(jù)處理1發(fā)現(xiàn)的問題，對等電點沉淀方法進行了改進。處理2實驗參數(shù)：5000 r/min離心15min，pH 4.6 HAc-NaAc緩沖溶液作為洗滌劑，（15+10）mL 0.1mol/L NaOH溶液復(fù)溶，其中15mLNaOH溶液直接加入到洗滌后的沉淀中，另外10mLNaOH溶液分別加入到兩個洗滌后分離了上清液的離心管中，復(fù)溶其中殘留的少量酪蛋白沉淀。表2是處理2方式下，測定的純牛乳中乳蛋白含量。

表2 處理2測定純牛奶中乳蛋白含量Table2 M ilk protein content in pure milk determined by processing method 2

改進后的方法酪蛋白質(zhì)量分數(shù)都在74%～76%，均大于73%。平均酪蛋白含量為2.33 g/100 g，乳清蛋白含量為0.38 g/100 g，酪蛋白質(zhì)量分數(shù)為75.06%，乳清蛋白質(zhì)量分數(shù)為12.17%。

圖1為處理2測定的純牛乳中酪蛋白、乳清蛋白質(zhì)量分數(shù)。從圖中可以看出，該處理方法所得數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

圖1 處理2測定純牛奶中乳蛋白含量Fig.1 Milk protein content in puremilk determined by processing method 2

處理1和處理2的結(jié)果進行對比，結(jié)果表明，處理2方法大大提高了酪蛋白的提取率，從而提高了酪蛋白質(zhì)量分數(shù)，同時提高了該方法的準確性和精確性。

2.2 純品酪蛋白制備條件的研究

等電點沉淀后分離得到的酪蛋白沉淀即粗品酪蛋白沉淀，純品酪蛋白的制備是通過洗滌的方式，除去酪蛋白分子中夾雜的乳清蛋白，提高酪蛋白的分利率。

2.2.1 洗滌劑的確定

兩種洗滌劑對體系pH的影響見表3。

由表3可以看出，pH 4.6 HAc-NaAc緩沖溶液對于體系pH的維持更加穩(wěn)定。故洗滌劑選用pH 4.6 HAc-NaAc緩沖溶液。

表3 兩種洗滌劑對體系pH的影響Table3 Two kinds of detergent effect on pH of system

2.2.2 洗滌次數(shù)的確定

洗滌次數(shù)對乳清蛋白感官的影響見表4，洗滌次數(shù)對乳蛋白含量的影響見表5。

表4 洗滌次數(shù)對乳清蛋白感官的影響Table4 W ashing times effect on whey sensory

表5 洗滌次數(shù)對乳蛋白含量的影響Tab le5 W ashing times effect on milk protein content

從表4中可以發(fā)現(xiàn)，僅沉淀處理下，乳清蛋白上清液最為澄清，且其中幾乎不含有酪蛋白沉淀。從表5中可以得出，（1）隨著洗滌次數(shù)增多，酪蛋白含量下降；（2）相同處理條件下，酪蛋白含量相似。一方面因為隨著洗滌次數(shù)增多，有部分沉淀帶到離心管壁上，且離心過程中，酪蛋白膠粒未能完全沉降，游離在上清液中，隨上清液流失；另一方面因為經(jīng)沉淀處理后，酪蛋白中仍可能存在著一些乳清蛋白未洗滌出來。故僅沉淀的處理方式可以將絕大部分乳清蛋白和酪蛋白進行分離。

2.3 酪蛋白沉淀復(fù)溶樣品的制備

通過實驗發(fā)現(xiàn)，NaOH添加量越高，復(fù)溶效果越好。但當添加量大于25mL，復(fù)溶效果差異大。采用旋渦混勻結(jié)合超聲的方式復(fù)溶，費時且總會有小顆粒固體沉淀未溶解。

3結(jié)論和建議

1）改進后的等電點沉淀測定方法，酪蛋白質(zhì)量分數(shù)都在74%～76%，均大于73%，可以有效的提高檢測的準確度，且該方法的精密度都有了顯著提高。

2）pH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液較蒸餾水作為洗滌劑，對于體系pH的維持更加穩(wěn)定。

3）3種洗滌方式的對比，僅沉淀的處理方式可以將大部分乳清蛋白和酪蛋白進行分離。采用該方法處理樣品，大大簡化了實驗操作步驟，方便易行。

4）本研究確定的酪蛋白沉淀復(fù)溶樣品制備方法是，向酪蛋白沉淀中加入0.1mol/L的NaOH溶液25mL～35mL，用旋渦混勻器進行混合，然后超聲30min，即得酪蛋白沉淀復(fù)溶溶液。

5）本研究確定的純牛奶中酪蛋白沉淀測定方法是，準確稱量20mL奶樣于100mL燒杯中，將燒杯置于磁力攪拌器上，攪拌同時用10%的乙酸溶液調(diào)節(jié)樣品的pH到4.6，然后將樣品轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，用5mLpH 4.6HAc-NaAc緩沖溶液洗滌燒杯，移液于離心管中。將離心管放入離心機，5 000 r/min離心15min，用25mL～35mL 0.1mol/LNaOH溶液堿復(fù)溶酪蛋白沉淀物，用旋渦混勻器進行混合，超聲30min，即得酪蛋白沉淀復(fù)溶溶液。最后用凱氏定氮法分別對酪蛋白復(fù)溶溶液、純牛奶進行含氮量測定，通過兩者的比值得到樣品中酪蛋白質(zhì)量分數(shù)，以此判斷純牛奶真實性問題。

[1]李宏梁,黃峻榕,李紅,等.酪蛋白質(zhì)量分數(shù)作為乳品摻假檢驗指標的探討[J].中國乳品工業(yè),2008,36(1)：52-54,62

[2]李宏梁,焦茜楠,黃峻榕,等.酪蛋白沉淀檢測方法機器在牛乳經(jīng)濟摻假鑒定中的應(yīng)用[J].食品科技,2008,33(12)：262-266,267

[3]丁慧.酪蛋白質(zhì)量分數(shù)作為乳品摻假鑒定指標的研究[D].陜西：陜西科技大學(xué),2010

[4]張芳,李紅旭.影響牛乳酪蛋白分離因素的研究[J].保鮮與加工, 2006,34(3)：29-31

[5]張東送,龐廣昌,高法國,等.毛細管電泳在牛乳中酪蛋白含量測定及摻假檢測方面的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,30(1)：130-132

[6]程濤,孫艷波,李健.雙縮脲法測定乳中酪蛋白含量[J].中國乳品工業(yè),2000,28(3)：33-35

[7]Dion M A M Luykx,Jan H G.Cordewener,et al.Identification of plant proteins in adulterated skimmed milk powder by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2007,1164(1/2)：189-197

[8]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所.GB 5009.5-2010食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部, 2010：1-4

Determination of Casein in Pure M ilk from M arket by Isoelectric Precipitation Combined w ith the Kjeldahl Method

SUNWen1，LIHong-liang1，*，WEILi-juan2，CAO Ji-li3，TANYuan3，HUIXiao1
（1.Collegeof Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China；2.Xi'an Supervision and Inspection Institute of Product Quality，Xi'an 710065，Shaanxi，China；3.Xi'an OrientalDairy Co.，Ltd.，Xi'an 710028，Shaanxi，China）

Based on the preliminary studies of measuring casein content，isoelectric point precipitation process was improved，combined with the Kjeldahl method to determine milk protein components in pure milk from market.The purpose was to determine the optimum detergent and washing times of preparation conditions of pure casein and the addition range of NaOH solution.Experimental results show that the casein contentsof the samples were in 74%to 76%in the improved way.It's more stable for the system to use pH 4.6 HAc-NaAc buffer solution as detergent.Mostwhey and casein could be separated without washing process.The optimum addition range of NaOH solution was25mL to35mL.The improved method was efficient，accurate，simple，workable and reproduce dwell.This test method could identify the adulteration of casein in pure milk.

milk；adulteration；alkaline casein；isoelectric precipitation；Kjeldahl method

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.025

2014-04-29

西安市農(nóng)業(yè)推進計劃項目（NC1208（3））

孫雯（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品檢驗與食品安全。

*通信作者