厚樸酚與和厚樸酚HPLC含量測定方法及厚樸提取工藝研究

任虹，何瑤，劉芳，傅超美，王世宇，張慧敏，余佳麗

·炮制制劑·

厚樸酚與和厚樸酚HPLC含量測定方法及厚樸提取工藝研究

任虹，何瑤，劉芳，傅超美，王世宇，張慧敏，余佳麗

目的：比較不同提取溶媒對厚樸中厚樸酚與和厚樸酚含量的影響，研究其提取工藝參數(shù)。方法：采用HPLC法測定不同提取液中厚樸酚與和厚樸酚的含量。色譜柱DiamonsilTMC18（250×4.6 mm，5 μm），甲醇-水（78:22）；流速1.0 mL．min-1；檢測波長294 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果：70%乙醇熱回流提取效果最佳。結(jié)論：不同提取溶媒對厚樸中厚樸酚與和厚樸酚含量有影響，70%乙醇熱回流提取法最好，為厚樸及其復(fù)方制劑提取工藝的規(guī)范化奠定基礎(chǔ)。

]厚樸；厚樸酚；和厚樸酚；乙醇；提取工藝

厚樸為木蘭科落葉喬木厚樸Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮[1]，是我國特有的珍貴中藥材，被列為我國特有的常用中藥材，因資源過度消耗日益枯竭，先后列為國家二級保護(hù)中藥材和國家二級保護(hù)植物[2]，具有燥濕、行氣、平喘的作用。其主要化學(xué)成分為厚樸酚、和厚樸酚、揮發(fā)油類、生物堿類等，具有抑菌、抗腫瘤、抗炎、促進(jìn)胃腸蠕動等藥理作用[3]。厚樸是多種中藥復(fù)方制劑的組方之一，通過查閱文獻(xiàn)可知在中藥復(fù)方制劑中，厚樸的提取方法多為用60%、70%、95%乙醇為溶媒進(jìn)行回流法或滲漉法提取，或先提取揮發(fā)油，再和其他藥味以水共煎幾種路線[4～7]，而對其質(zhì)量評價多以厚樸酚與和厚樸酚總量為指標(biāo)。本實驗以HPLC法測定厚樸酚與和厚樸酚含量，考察60%、70%、95%乙醇三種溶媒熱回流提取法，以期為厚樸及其復(fù)方制劑提取工藝的規(guī)范化奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

實驗所用的儀器包括：Agilent1200高效液相色譜儀（Agilent 1200二極管陣列檢測器；四元泵在線脫氣系統(tǒng)；Agilent 1200色譜工作站）（美國安捷倫科技有限公司）；DiamonsilTMC18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm，美國迪馬公司）；Mettler AE240十萬分之一電子分析天平（德國Mettler公司）；FA1104萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；厚樸酚（批號：H-004-120113）、和厚樸酚（批號：H-005-111213）均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純（美國fisher公司產(chǎn)品）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

厚樸飲片，購于科倫醫(yī)藥貿(mào)易有限公司，藥材經(jīng)檢查均符合《中國藥典》2010年版一部中有關(guān)各項規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成已知濃度為0.330 mg．mL-1、0.329 mg．mL-1的溶液，即得。

2.2 厚樸供試品溶液的制備

稱取厚樸飲片，每組40 g，分別加入60%、70%和95%濃度的乙醇回流提取3次，第一、二次分別加入乙醇200 mL，第三次加入乙醇150 mL，每次回流提取1 h，濾過，合并三次濾液，定容至500 mL。分別精密量取厚樸三種提取液25 mL，置于蒸發(fā)皿中揮干，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，即得60%、70%和95%三種不同濃度乙醇溶媒熱回流提取的厚樸供試品溶液。

圖1 厚樸酚與和厚樸酚色譜圖譜

2.3 色譜條件

實驗色譜柱為DiamonsilTMC18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm，美國迪馬公司）；流動相為甲醇-水（78：22）；流速1.0 mL．min-1；檢測波長294 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。將厚樸酚與和厚樸酚對照品溶液、厚樸供試品溶液注入色譜儀，得色譜圖，見圖1。供試品中的厚樸酚與和厚樸酚能與其他峰達(dá)到基線分離，厚樸酚峰保留時間約為13.2 min，和厚樸酚峰保留時間約為8.6 min，分離度均大于1.5。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將“2.1”項下制備得到的厚樸酚對照品溶液，分別進(jìn)樣4,6,8,10,12,14μL，以厚樸酚峰面積Y1為縱坐標(biāo)，厚樸酚對照品含量X1為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y1=1433X1－51.83，r=0.9999。結(jié)果表明，在1.32～4.62 μg，厚樸酚峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。將“2.1”項下制備得到的和厚樸酚對照品溶液，分別進(jìn)樣2，4，6，8，10 μL，以和厚樸酚峰面積Y2為縱坐標(biāo)，和厚樸酚對照品含量X2為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y2=1308X2－21.33，r=0.9997。結(jié)果表明，在0.66～3.3 μg，和厚樸酚峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.1”項下制備得到的厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項下條件測定峰面積。結(jié)果厚樸酚峰面積平均值為4682.73，RSD為0.12%；和厚樸酚峰面積平均值為4299.03，RSD為0.13%。表明此法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

分別精密稱取厚樸藥材6份，按“2.2”項下方法制成供試品溶液，按“1.2.3”項下條件分別測定厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的含量。厚樸酚平均含量390.33 mg，RSD為1.02%；和厚樸酚平均含量214.34 mg，RSD為1.26%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

稱取厚樸藥材按“2.2”項下方法制成供試品溶液，室溫放置，按“2.3”項下條件，分別于0,4,8,12,18,24 h進(jìn)樣。測得厚樸供試品溶液中厚樸酚峰面積平均值為5596.79，RSD為1.93%；和厚樸酚峰面積平均值為2786.65，RSD為2.03%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取5份已知含量的供試品（厚樸60%乙醇熱回流提取），分別加入適量厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品，按“2.2”項下厚樸供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依法測定，并分別計算回收率，結(jié)果見表1、2，此法具有良好的回收率。

表1 厚樸酚回收率試驗結(jié)果（n=3）

表2 和厚樸酚回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.9 含量測定

取厚樸60%、70%、95%乙醇熱回流提取液，制備得到的供試品溶液，分別按“2.3”項下條件進(jìn)樣，對厚樸酚與和厚樸酚進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表3。

表3 厚樸中厚樸酚與和厚樸酚含量測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果顯示，以厚樸酚、和厚樸酚為評價指標(biāo)，70%乙醇熱回流提取效果最好，含量最高。中藥有效成分溶出的多少，提取溶媒是關(guān)鍵之一，本實驗只通過不同提取溶媒對厚樸中厚樸酚與和厚樸酚溶出的影響進(jìn)行了研究，但不能僅以這兩種成分為指標(biāo)評價提取溶媒的優(yōu)劣，應(yīng)同時引入對提取時間、提取次數(shù)以及提取的溶媒量進(jìn)行考察，并立足于厚樸的物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床療效，從中藥多成分層面上考慮“譜效關(guān)系”[8～11]，建立不同提取方法的指紋圖譜，并尋找指紋圖譜與療效的內(nèi)在關(guān)系，建立體現(xiàn)“譜-證-效”的質(zhì)量控制方法，或者采用HPLC-MS、GC-MS進(jìn)行研究，尋找厚樸的化學(xué)成分變化規(guī)律，以更加完善厚樸及其中藥復(fù)方制劑的提取工藝。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:235.

[2] 斯金平,童再康,曾燕如,等.厚樸種質(zhì)資源評價與利用研究[J].中藥材,2002,25(2):79.

[3] 劉穎新,劉利利,喻祖文,等.星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化厚樸提取溶媒[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,7(19):27.

[4] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)—中藥成方制劑第7冊[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:205.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1234.

[6] 單洪巖.藿香正氣片制藥溶媒及質(zhì)量控制研究[D].吉林大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文,2008.

[7] 王凌,周震.加味藿香正氣滴丸提取工藝研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(11):58.

[8] 雷虹,段曉鵬,鄧俊林,等.中藥譜效學(xué)溶度參數(shù)制樣法考察[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(20):6.

[9] 曾建紅,莫炫永,戴平,等.廣西莪術(shù)揮發(fā)油抗腫瘤作用的譜效關(guān)系研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(13):91.

[10] 宋玉超,崔秀榮,連超杰,等.赤芍、白芍涼血作用比較研究(Ⅱ)—抑制脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的譜效分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(6):181.

[11] 何瑤.譜效結(jié)合評價四物湯提取工藝[D].成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010.

(責(zé)任編輯：胡慧玲)

Study on the HPLC determination of magnolol and honokiol and extraction technology of Houpo/

REN Hong, HE Yao,LIU Fang, FU Chao-mei, WANG Shi-yu, ZHANG Hui-min, YU Jia-li//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To compare the infuence of different extracting solvent on the content of magnolol and honokiol in Houpo and optimize the extraction parameters. Method:HPLC was applied to determine the contents of magnolia and honokiol in different extracting solvent of Houpo. The samples analysis were performed on a Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) column with mobile phase of CH30H:H20 (78:22),at a fow rate of 1.0 mL．min-1. The column temperature was 30 ℃,and the detection wavelength was set at 294 nm. The injection volume was 5 μL. Result: 70% ethanol was the best extracting solvent for the extraction. Conclusion: Different extracting solvent has infuence on the extraction rate. 70% ethanol thermal circumfuence extraction is good for extraction. The study lays a foundation for the standardization of extraction process of Houpo and its compound preparation.

Houpo; magnolia; honokiol; ethanol; extraction technology

R 283

A

1674-926X(2014)02-009-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)?；穑ň幪枺篫RYB201111）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

任虹，女，在讀碩士研究生，從事中藥新制劑和新劑型的研究

Tel:15882232829 Email:363568917@qq.com

王世宇，女，副教授，從事中藥新制劑和新劑型的研究 Tel:13708051074

2013-09-30