HPLC法同時測定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量

李敏，孫蓮，孟磊

（新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011）

HPLC法同時測定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量

李敏，孫蓮*，孟磊

（新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011）

建立HPLC法同時測定旱芹中木犀草素和旱芹素含量的方法。采用C18（150mm×4.6mm，5μm）柱，流動相為乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=40∶60，等強度洗脫，檢測波長330 nm，柱溫25℃，流速1.0m L/min。木犀草素和旱芹素的質量濃度分別在0.93μg/mL～4.94μg/mL（r=0.9991）及1.03μg/mL～5.06μg/mL（r=0.999 4）范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，平均加樣回收率依次為99.7%（RSD為2.4%），99.0%（RSD為1.8%）。

旱芹；木犀草素；旱芹素；高效液相色譜法

旱芹（Apium graveolens L.）是傘形科旱芹屬的草本植物。我國古代已有研究，具有“補血、祛風、健脾利濕”的作用，自古有“藥芹”之譽。旱芹為藥食兩用植物[1-2]，被稱為“廚房中藥材”。旱芹含有豐富的黃酮類化合物，黃酮是旱芹中主要的活性成分，旱芹中的黃酮類成分主要為木犀草素和旱芹素等，旱芹黃酮具有抗氧化，鎮(zhèn)靜，止痛，抗肝炎，降壓，降脂作用以及抗腫瘤作用[3-5]。由此可見，旱芹是一種具有很高藥用價值和營養(yǎng)價值的植物，研究旱芹黃酮具有重要的意義，本文建立了HPLC法同時檢測旱芹中的木犀草素和旱芹素含量[6-7]的方法，為旱芹的質量控制和開發(fā)利用提供基礎資料。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilentl200高效液相色譜儀（包括G1322A脫氣裝置、G1312B二元高壓泵、G1367C高性能自動進樣器、GI316B柱溫箱、G1315C二極管陣列檢測器）：美國，安捷倫科技有限公司，XS105型十萬分之一電子天平：德國，梅特勒一托利多儀器有限公司。

1.2 供試品與試劑

乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水：娃哈哈飲用水；木犀草素標準品（22803）：上海晶純實業(yè)有限公司；旱芹素標準品（A0113）：成都曼斯特生物科技有限公司。

新鮮自然成熟的旱芹地上部分，采自烏魯木齊市郊區(qū)菜園，經新疆醫(yī)科大學藥學院生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為傘形科旱芹屬植物旱芹（Apium graveolens L.），分離莖和葉，用適量水洗凈，干燥，粉碎。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相：乙腈：0.01mol/L醋酸銨（調pH為4.8）=40∶60，檢測波長330 nm，柱溫：25℃，流速為：1.00mL/min，進樣量為：10μL，在上述色譜條件下，木犀草素和旱芹素色譜峰保留時間合適，峰形良好，供試品中木犀草素和旱芹素與其他組分分離良好，分離度＞1.5，木犀草素和旱芹素的質量濃度分別在0.93μg/mL～4.94μg/mL（r= 0.999 1）及1.03μg/mL～5.06μg/mL（r=0.999 4）范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）及供試品（B）色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of refercnce substances（A）and sample（B）

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取木犀草素對照品4.0mg，旱芹素對照品5.8mg置于25mL的容量瓶中，甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得0.16mg/mL木犀草素及0.23mg/mL旱芹素的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取過60目篩的旱芹莖粉末1.000 0 g置于125mL錐形瓶中，加80%甲醇溶液30mL，于40℃時超聲提取30min，過濾，濾渣再用30mL 80%甲醇，同法提取2次，合并濾液和洗滌液，減壓濃縮，殘渣用少量甲醇溶解，轉移到10mL的容量瓶中，用甲醇定溶至刻線，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取木犀草素對照品溶液60、70、80、240、400、600、700μL和旱芹素對照品溶液10、25、35、55、75、96、115μL于5mL容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻線，配成不同濃度的混合標液，在上述色譜條件下進樣10μL，測定峰面積。以木犀草素和旱芹素進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程及線性范圍見表1。

表1 回歸方程、相關系數及線性范圍Table1 The regression equation，correlation coefficient and linear range

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液5μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結果木犀草素、旱芹素峰面積的RSD分別為2.9%、1.7%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，依上述色譜條件，在0、1、4、8、12、24 h分別進樣5μL，測定峰面積。結果木犀草素、旱芹素含量的RSD分別為1.8%、2.6%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取旱芹莖供試品5份，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，依上述色譜條件，進樣10μL，測定峰面積。結果木犀草素、旱芹素含量的RSD分別為1.3%、1.7%，表明重復性良好。

2.8 回收率試驗

取“2.7”項下已測知木犀草素、旱芹素含量的旱芹莖供試品共18份，精密稱定，分別置125mL錐形瓶中，再分別以低、中、高3個濃度精密加入木犀草素、旱芹素的對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制成供試溶液，依上述色譜條件進樣，測定峰面積。結果木犀草素、旱芹素的平均回收率分別為99.5%（RSD=1.1%）、100.1%（RSD=1.3%），結果見表2。

2.9 供試品含量測定

取3批旱芹莖和葉的供試品，分別按照“2.3”項下方法制備供試品溶液各3份，依上述色譜條件進樣，測定峰面積，以外標法計算含量，結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果Table2 Recovery test results

表3 供試品的含量測定結果Table3 Results of content determination of samples

3 結論

建立了同時測定旱芹中木犀草素和旱芹素含量的方法。該方法的線性系數均在0.999以上，平均加樣回收率為99.7%和99.0%，相對標準偏差為2.4%和1.8%。實驗結果表明，本方法行之有效，穩(wěn)定可靠，適用于測定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

取木犀草素和旱芹素對照品溶液在200 nm～ 450 nm區(qū)間掃描。結果表明，木犀草素在355 nm處有最大吸收，而旱芹素在270 nm處有最大吸收，故選擇330 nm作為檢測波長，在此波長下的兩種組分都有較好的吸收，木犀草素和旱芹素在此波長處可獲得較好的分離。

4.2 流動相的選擇

分別考察了甲醇-0.01mol/L醋酸銨，乙腈-0.01mol/L醋酸銨，甲醇-乙腈-0.01mol/L醋酸銨溶液等為流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01mol/L醋酸銨為流動相時，分離較好，木犀草素和旱芹素在8min內完全分離。分別試驗了乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=90∶10、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=80∶20、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=70∶30、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH= 4.8）=60∶40、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=50∶50、乙腈∶0.01 mol/L醋酸銨（pH=4.8）=40∶60、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=30∶70為流動相，結果表明乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=40∶60為流動相時，木犀草素和旱芹素峰形較好，并且分離較好。同時還試驗了0.01mol/L醋酸銨的pH為3.5、3.8、4.0、4.5、4.8、5.0、5.5時的分離效果，發(fā)現(xiàn)緩沖鹽的pH為4.8時，旱芹素和木犀草素分離效果較好，基線較平穩(wěn)。故本實驗選擇乙腈∶0.01mol/L醋酸銨（pH=4.8）=40∶60為流動相，等梯度洗脫，流速為1.0mL/min。

[1]宋小俊,王怡婷.旱芹藥用功能研究概述[J].安徽農業(yè)科學,2008, 36(15):360-361

[2]沈明高,金陽,李薇雅.旱芹的化學成分及其藥理作用[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(4):1474-1475,1489

[3]劉全德,唐世榮,宋慧,等.超聲波-微波協(xié)同萃取旱芹黃酮的工藝研究[J].食品與機械,2010,26(5):134-136

[4]何書美,劉敬蘭.旱芹中黃酮類物質的提取和測定[J].分析實驗室,2008,25(8):85-87

[5]龐玲玲,李若然,周林福,等.旱芹素對哮喘小鼠轉錄激活蛋白3及Th2型細胞因子抑制作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2010,30(4):383-387

[6]王克勤,羅軍武,陳靜萍,等.高效液相色譜法測定旱芹中旱芹素含量[J].食品與機械,2009,25(2):74-77

[7]王克勤,羅軍武,陳靜萍,等.旱芹提取物中旱芹素的HPLC與HPTLC定量分析研究[J].食品科學,2008,29(4):291-295

Determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L.by HPLC

LI Min，SUN Lian*，MENG Lei
（College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，Xinjiang，China）

To establish a method for simultaneous determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L. by HPLC.The sepration was performed on an C18column with acetonitrile0.01mol/L ammonium acetate（pH=4.8）= 60∶40 as a mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was 330 nm at25℃.There were good linear relationships between the mass concentrations and the peak areas of luteolin and apigenin in the ranges of 0.93μg/mL-4.94μg/mL（r=0.9991）and 1.03μg/mL-5.06μg/mL（r=0.999 4）respectively.The average recoveries were99.7%with RSD 2.4%and 99.0%with RSD 1.8%respectively.The method was quick，simple and repeatable for the determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L.

Apium graveolen L.；luteolin；apigenin；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.029

2013-03-08

李敏（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產物活性成分研究與利用。

*通信作者：孫蓮（1961—），女（漢），教授，碩士，研究方向：藥物分析。