水產(chǎn)品孔雀石綠和隱性孔雀石綠快速定量檢測研究

桑麗雅，朱曉華，鄭百芹，董李學，邵偉，王振國

（1.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州310022；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京210017；3.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北唐山063000）

水產(chǎn)品孔雀石綠和隱性孔雀石綠快速定量檢測研究

桑麗雅1，朱曉華2，鄭百芹3，董李學3，邵偉1，王振國1

（1.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州310022；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京210017；3.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北唐山063000）

采用膠體金免疫層析方法建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的定量檢測，并對其樣品前處理方法進行了研究。結(jié)果表明，孔雀石綠的線性范圍為0.25μg/L～8μg/L，線性系數(shù)0.996 1；優(yōu)化后孔雀石綠提取液的pH為4.5，對甲苯磺酸濃度為0.06mol/L，凈化劑為2 g中性氧化鋁，脫水劑為2 g氯化鈣，氧化劑為100μL 0.1%四氯苯醌；孔雀石綠加標回收率為80.1%～89.6%，隱性孔雀石綠加標回收率為66.9%～72.9%，相對標準偏差1.07%～8.14%。

孔雀石綠；隱性孔雀石綠；水產(chǎn)品；膠體金；樣品前處理

孔雀石綠（malachite green，MG）屬三苯甲烷類化學物質(zhì)，被廣泛用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[1]?？兹甘G及其代謝物隱形孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）在動物體內(nèi)會產(chǎn)生高殘留，殘留時間可達100 d以上，對人體具有致癌、致畸和致突變的副作用[2]。世界上許多國家已將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，中國也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》（農(nóng)業(yè)部第193號公告）。

孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠的主流檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[3-4]，該技術(shù)除需配備昂貴的大型儀器和大量輔助實驗設(shè)備外，前處理方法過于繁雜耗時，無法應(yīng)對水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管發(fā)展需求。近幾年，農(nóng)業(yè)部在水產(chǎn)品監(jiān)管方面引入市場準入與質(zhì)量追溯試點工作，免疫膠體金快速檢測技術(shù)因具有簡便、快速、靈敏、便宜的優(yōu)點，被廣泛用于對產(chǎn)地和流通市場的樣品進行常規(guī)篩選檢測[5]。

孔雀石綠是水產(chǎn)品藥物殘留必檢項目之一，但是當前市面上的孔雀石綠快速檢測試劑盒質(zhì)量卻差強人意，一方面前處理方法涉及過柱等步驟不夠簡單快速，另一方面不能同時檢測顯性和隱性孔雀石綠，且不能實現(xiàn)定量檢測[6]。針對此種情況，本試驗對水產(chǎn)品中孔雀石綠及代謝物的前處理方法作了深入研究，并應(yīng)用到免疫膠體金快速檢測方法中實現(xiàn)對顯隱性孔雀石綠的快速定量檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料

經(jīng)LC-MS/MS法（GB/T 19857-2005.水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定）確證的陰性南美白對蝦、鯽魚。

1.1.2 試劑

孔雀石綠（MG）、隱性孔雀石綠（LMG）：美國Sigma公司；對甲苯磺酸、乙酸銨、鹽酸羥胺、乙腈、中性氧化鋁、硅藻土、正己烷、氯化鈣、過氧化鉛、高碘酸、四氯苯醌、高錳酸鉀（均為分析純）：華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司；30%雙氧水：西安三浦化學試劑有限公司；孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試劑板：杭州南開日新生物技術(shù)有限公司實驗室自制。

1.1.3 儀器

PL-203電子天平：梅特勒-托利多（中國）；SRH-S 450均質(zhì)機：上海世赫機電設(shè)備有限公司；TDL-40C低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；DCY-08空氣吹干儀：杭州南開日新生物有限公司；HG-8金標讀數(shù)儀：杭州南開日新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制定標準曲線

用乙腈和磷酸鹽（PBS）緩沖液配制系列濃度孔雀石綠標準品溶液：0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、16、20、100μg/L。不同濃度孔雀石綠標準品液用膠體金快速檢測試劑板測定，測定結(jié)果T/C值（T—檢測線的吸光值，C—控制線的吸光值）用金標讀數(shù)儀讀取。以孔雀石綠標準品液濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制曲線。

1.2.2 樣品前處理方法的初步確定

取魚、蝦等水產(chǎn)樣品的可食肌肉部分，用均質(zhì)機均質(zhì)；稱取5 g均質(zhì)后樣品于50 mL離心管中；加入3mL鹽酸羥胺、對甲苯磺酸和乙酸銨的混合提取液、10mL乙腈和凈化劑到離心管中，劇烈振蕩3min；加入Xg氯化鈣，劇烈振蕩1min后，室溫下4 000 r/min離心5min；移取5mL上清液于離心管中，加入氧化劑，混合均勻1min后，65℃用氮氣或空氣吹干；向吹干的試管中加入2.5mL pH7.4 PBS緩沖液，沖洗溶解試管內(nèi)壁上殘留物，靜置2min，吸取至少0.1mL溶液，待檢。樣品稀釋倍數(shù)為1。

1.2.3 樣品提取液的優(yōu)化

1.2.3.1 不同pH緩沖液對孔雀石綠回收率的影響

配制pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乙酸銨緩沖溶液，3μg/kg孔雀石綠加標樣品做前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板，用金標讀數(shù)儀測定T/C值，代入標準曲線計算回收值，計算回收率，考察不同pH乙酸銨緩沖液對孔雀石綠回收率的影響。

1.2.3.2 不同濃度對甲苯磺酸對孔雀石綠回收率的影響

配制對甲苯磺酸系列濃度溶液：0.03、0.045、0.06、0.075、0.09mol/L，3μg/kg孔雀石綠加標樣品做前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板，用金標讀數(shù)儀測定T/C值，計算回收率，考察不同濃度對甲苯磺酸溶液對孔雀石綠回收率的影響。

1.2.4 樣品凈化劑的優(yōu)化

3μg/kg孔雀石綠加標樣品的前處理過程中分別加入不同凈化：中性氧化鋁（過中性氧化鋁柱和直接添加2 g中性氧化鋁兩種方式）、3 g硅藻土、正己烷，前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板，用金標讀數(shù)儀測定T/C值，計算回收率，考察不同凈化劑對孔雀石綠回收率的影響。

1.2.5 樣品脫水劑的優(yōu)化

3μg/kg孔雀石綠加標樣品的前處理過程中分別加入不同量0.5、1、2、4、6 g CaCl2，振蕩離心后觀察上清液體積、記錄吹干時間，計算回收率。

1.2.6 樣品中隱性孔雀石綠氧化條件的優(yōu)化

添加隱性孔雀石綠標準品到5 g空白水產(chǎn)品中，使終濃度為3μg/kg。樣品前處理過程中分別加入不同氧化劑：100μL雙氧水、100mg過氧化鉛、10μL 1%高碘酸溶液、100μL 0.1%四氯苯醌、10μL 1%高錳酸鉀溶液，樣品前處理后滴定孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板，用金標讀數(shù)儀測定T/C值，計算回收率，考察不同氧化劑對隱性孔雀石綠的轉(zhuǎn)化效果。

1.2.7 方法的回收率和精密度測定

經(jīng)LC-MS/MS法確證后的孔雀石綠陰性鯽魚、南美白對蝦樣品中，分別添加0.25、2、8μg/kg孔雀石綠和隱性孔雀石綠標準品液，每個濃度做6個平行，經(jīng)優(yōu)化后的樣品前處理后，用孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板和金標讀數(shù)儀測定T/C值、計算回收率、相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

配制孔雀石綠梯度系列濃度，用膠體金快速檢測試劑板測定，顯色結(jié)果（T/C值）用金標讀數(shù)儀讀取。由圖1可見，孔雀石綠的標準曲線冪方程為y=1.1686x-0.396，R2=0.996 1。孔雀石綠在0.25μg/L～8μg/L范圍內(nèi)具有很好的線性。

圖1 孔雀石綠免疫膠體金檢測標準曲線Fig.1 The standard curve of immunographic colloidal gold

2.2 提取緩沖液最佳pH

孔雀石綠是一種偏堿性物質(zhì)，在酸性條件下容易被提取出來。不同pH乙酸銨緩沖液對孔雀石綠回收率的影響見圖2。

圖2 不同pH乙酸銨緩沖液對孔雀石綠回收率的影響Fig.2 The influence of various pH of amine acetate buffer solution on the malachite green recovery ratio

由圖2可見，當緩沖溶液的pH為4.5時，水產(chǎn)樣品回收率最高，因此確定提取水產(chǎn)樣品中孔雀石綠的最佳pH為4.5。

2.3 提取液中對甲苯磺酸的最佳濃度

對甲苯磺酸溶液作為離子對試劑，有利于孔雀石綠形成離子對，增加乙腈對該物質(zhì)的提取效率[7]。不同濃度對甲苯磺酸溶液對孔雀石綠回收率的影響見圖3。

圖3 不同濃度對甲苯磺酸溶液對孔雀石綠回收率的影響Fig.3 The influence of p-toluenesulfonic acid solution on the malachite green recovery ratio

由圖3可見，增加對甲苯磺酸溶液濃度樣品回收率隨之增加，當對甲苯磺酸濃度大于0.06mol/L時，增加用量回收率變化不大。故5 g含孔雀石綠含量24μg/L的水產(chǎn)樣品需要0.06mol/L的對甲苯磺酸溶液3mL。

2.4 凈化劑

孔雀石綠脂溶性，為提高提取效率，需要除脂。不同凈化劑對孔雀石綠回收率的影響見圖4。

圖4 不同除脂劑對孔雀石綠回收率的影響Fig.4 The influence of various degreasing agents on the malachite green recovery ratio

由圖4可見，中性氧化鋁的除脂效果最好，過柱和添加粉末兩種方式效果差別不大，硅藻土和正己烷的除脂效果較差。試驗結(jié)果從另一方面說明了待檢樣品溶液中脂肪含量高對檢測結(jié)果的影響很大。

2.5 脫水劑

因乙腈與提取液中的水互溶，考慮后續(xù)吹干步驟及提高提取率需要除水。為減少吹干溶劑體積，選用除水效果好的固相脫水劑CaCl2。加入不同量CaCl2離心后，見圖5。

圖5 加入不同量CaCl2離心后的液體分層情況Fig.5 The centrifugal liquid stratifications after adding different concentrations of CaCl2

從圖5可知，離心后離心管中混合物共分成3層，下層固體層為肉樣、中性氧化鋁、氯化鈣混合物，中間液體層主要成分為水，上層液體層主要成分為乙腈。

各液體層體積、5mL上層液體溶液吹干時間及回收率情況，見表1。

從表1數(shù)據(jù)來看，隨著CaCl2用量增加，水層的體積依次增加，乙腈層的體積依次減少，5mL上層液體吹干時間呈減少趨勢，但CaCl2用量為0.5 g和1 g的吹干時間差不多，用量為2、4、6 g的吹干時間差不多。但是就回收率來看，CaCl2用量為2 g時最高，用量4 g和6 g反而降低。筆者分析原因可能是過量的CaCl2一方面阻礙了中性氧化鋁的除脂效果，另一方面在脫樣品組織水分的同時帶出了蛋白、脂肪等雜質(zhì)，而回收率受樣品提取液中脂肪雜質(zhì)的影響很大。故從上層液體吹干時間和回收率這兩個因素考慮，CaCl2的適宜用量為2 g。

表1 不同用量CaCl2對吹干時間和回收率的影響Table1 The influence of various concentrations of CaCl2on drying time and recovery ratio

2.6 氧化劑

試驗材料孔雀石綠膠體金快速檢測試劑板不能直接檢測隱性孔雀石綠，需要將隱性轉(zhuǎn)化為顯性。不同氧化劑對隱性孔雀石綠回收率的影響見圖6。

圖6 不同氧化劑對隱性孔雀石綠回收率的影響Fig.6 The influence of various oxidants on recovery ratio

由圖6可見，雙氧水、過氧化鉛和高錳酸鉀不能轉(zhuǎn)化隱性孔雀石綠為顯性孔雀石綠，10μL 1%高碘酸溶液和100μL 0.1%四氯苯醌的轉(zhuǎn)化率較好，根據(jù)回收率高低，選擇100μL 0.1%四氯苯醌為最適氧化劑。

2.7 方法的回收率和精密度

用本研究方法測定孔雀石綠和隱性孔雀石綠添標鯽魚、南美白對蝦樣品，添加濃度分別為0.25、2、8μg/kg，測定的回收率和相對標準偏差見表2。

3 小結(jié)

本研究對水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的提取技術(shù)進行了研究，并采用免疫膠體金層析技術(shù)建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的定量檢測方法。優(yōu)化后孔雀石綠提取液的pH為4.5，對甲苯磺酸濃度為0.06mol/L，凈化劑為2 g中性氧化鋁，脫水劑為2 g氯化鈣，氧化劑為100μL 0.1%四氯苯醌。該方法的線性范圍為0.25μg/L～8μg/L，線性系數(shù)0.996 1，孔雀石綠加標回收率80.1%～89.6%，隱性孔雀石綠加標回收率為66.9%～72.9%，相對標準偏差1.07%～8.14%。

表2 樣品添標回收率和精密度Table2 The recovery ratio and precision after adding the standard solution

[1]Bergwerff A A,Kuiper R V,Scherpenisse P.Persistence of residues of malachite green in juvenile eels(Anguilla anguilla)[J].Aquaculture,2004,233(1/4):55-63

[2]孫滿義,楊賢慶,岑劍偉,等.水產(chǎn)品中孔雀石綠的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2009(2):312-315

[3]中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局,廈門出入境檢驗檢疫局,廣東出入境檢驗檢疫局,等.GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定[S].北京:中國標準出版社,2005

[4]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.GB/T 20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法[S].北京:中國標準出版社,2006

[5]張素青,李青春,陳永平,等.膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)品藥物殘留檢測中的應(yīng)用[J].科學養(yǎng)魚,2011(11):44-46

[6]錢蓓蕾,王媛,蔡友瓊.孔雀石綠快速檢測試劑盒的比較研究以及在水產(chǎn)品監(jiān)控中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2011,26(10):19-21

[7]曹慧,管驍,張小剛,等.水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測及殘留提取技術(shù)[J].湖南農(nóng)業(yè)科學,2011(11):100-103

Study on Rapid and Quantitative Detection for Malachite Green and Leucomalachite Green in Aquatic Product

SANG Li-ya1，ZHU Xiao-hua2，ZHENG Bai-qin3，DONG Li-xue3，SHAO Wei1，WANG Zhen-guo1
（1.Hangzhou Nankai Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou，310022，Zhejiang，China；2.Freshwater Fisheries Research institute of Jiangsu Province，Nanjing，210017，Jiangsu，China；3.Tangshan animal husbandry and aquatic productsˊquality Monitoring Center，Tangshan，063000，Hebei，Chnia）

Using colloidal gold immunochromatography assay to detect the content of malachite green（MG）and leucomalachite green（LMG）in aquatic products，and study on sample pretreatment.The results showed that the linear range and the correlation coefficient R2of this method were0.25μg/L-8μg/Land 0.996 1；the optimal pH and p-toluenesulfonic acid concentration of extracting solution were 4.5 and 0.06mol/L；the optimal purifying agent，dehydrating agent and oxidant were neutral alumina，calcium chloride and chloranil；the recovery rate of MG and LMG were 80.1-89.6%and 66.9-72.9%，respectively，and the relative standard deviation was1.07%-8.14%.

Malachite Green；Leucomalachite Green；Aquatic Products；Colloidal Gold；Sample Pretreatment

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.025

2012-11-02

杭州市種子資金項目（20102431K62）

桑麗雅（1982—），女（漢），高級工程師，碩士，主要從事食品安全快速檢測試劑的開發(fā)。