AB-8樹脂分離純化荷葉總黃酮的研究

張蕾，李梅香，吳秀玲，喬旭光

（1.濟寧職業(yè)技術(shù)學院，山東濟寧272000；2.山東農(nóng)業(yè)大學食品學院，山東泰安271018）

AB-8樹脂分離純化荷葉總黃酮的研究

張蕾1，李梅香1，吳秀玲1，喬旭光2，*

（1.濟寧職業(yè)技術(shù)學院，山東濟寧272000；2.山東農(nóng)業(yè)大學食品學院，山東泰安271018）

研究AB-8大孔樹脂對荷葉總黃酮的分離純化工藝，確定吸附和洗脫條件。結(jié)果表明荷葉黃酮物質(zhì)可以較好的利用AB-8型樹脂進行分離純化，得到最佳吸附工藝為v吸附流速=3BV/h，c吸附原液=2.08mg/mL，pH=6及最佳解析工藝為洗脫劑為乙醇溶液，c乙醇=80%，v洗脫流速=1.5BV/h，V洗脫劑用量=3BV。經(jīng)過AB-8型樹脂在此工藝條件下對荷葉黃酮進行精制，其純度可達59.31%。

荷葉；黃酮；大孔樹脂；分離純化

荷葉資源豐富，富含黃酮類物質(zhì)。荷葉黃酮能擴張血管，降壓調(diào)脂減肥，對平滑肌有解毒作用，能抗有絲分裂、抑菌和止痙攣，具有顯著生理活性[1-2]。目前，主要應(yīng)用樹脂法、萃取法、高速逆流色譜技術(shù)法和超臨界CO2萃取等方法從天然植物中富集分離黃酮類化合物[3-4]。大孔樹脂比表面積高，具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠選擇性的吸附有機物質(zhì)，從而實現(xiàn)天然產(chǎn)物的分離提純，特別適合分離提純糖苷類、黃酮類、皂苷類等成分。利用大孔樹脂進行分離，可實現(xiàn)較大的吸附容量、溫和的解析條件、較低成本等，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物研究，富集分離效果較好[5]。AB-8型大孔吸附樹脂是一種弱極性的聚苯乙烯型聚合物吸附劑，有研究表明黃酮類物質(zhì)的分離富集可應(yīng)用AB-8型大孔吸附樹脂，效果較好[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

UV—2000型紫外分光光度計：上海UNICO儀器有限公司；QL-866漩渦混和器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；超聲波細胞粉碎機：上海生析超聲儀器有限公司；層析柱。

蘆?。≧utinu）：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司。亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁，乙醇，鹽酸，分析純。AB-8型大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷葉黃酮物質(zhì)的提取方法

新鮮荷葉，干燥粉碎。將樣品用超聲波法進行處理，用乙醇提取荷葉黃酮濃度為70%料液比為1∶30。提取完畢，過濾，用石油醚萃取過濾液（V∶V=1∶1）。減壓真空濃縮棄去石油醚層的黃酮提取液，經(jīng)定容后得到荷葉黃酮提取液。

1.2.2 荷葉黃酮物質(zhì)的測定方法[7]

根據(jù)黃酮類物質(zhì)能與金屬離子通過絡(luò)合作用生成紅色化合物的原理，故采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系制作荷葉黃酮測定標準曲線且得到回歸方程Y= 0.524 4x-0.005 1，R2=0.999 9[14]。本研究中的樣液均以此法處理，測定吸光值，進而通過該方程得到荷葉黃酮的含量。

1.2.3 AB-8大孔吸附樹脂的預(yù)處理方法[8]

樹脂用乙醇進行濕法裝柱。用乙醇處理樹脂直至流出液與適量水混合后為澄清，用去離子水沖洗樹脂，直至流出液無醇味。先用5%鹽酸溶液處理樹脂，流速為5 BV/h，用量為4 BV，且浸泡樹脂3 h，再用去離子水沖洗樹脂直至出水pH為中性，流速為5BV/h。用4BV濃度為5%的氫氧化鈉溶液以5 BV/h的流速處理樹脂層，浸泡樹脂3 h，再用去離子水沖洗樹脂直至出水pH為中性，流速為5 BV/h。進行裝柱時，柱內(nèi)應(yīng)先放有水。

1.2.4 AB-8樹脂對荷葉總黃酮的靜態(tài)吸附率與解吸率測定方法[9]

分別稱取1 g預(yù)處理過樹脂于具塞三角瓶中，加入黃酮提取液（V體積=100mL，C初=0.8mg/mL），置于搖床上振蕩24 h。過濾后，按照1.2.2中方法測定濾液中荷葉黃酮濃度。

用去離子水洗滌以上樹脂，然后加入濃度為90%的乙醇溶液，振蕩24 h，過濾，再測定濾液中荷葉黃酮濃度[14]。

Q為黃酮吸附量，（mg/g）；C初為黃酮提取液原始濃度，（mg/mL）；C剩為解析后剩余黃酮濃度，（mg/mL）；V為體積；W為樹脂干重（105℃下烘干相同重量的濕樹脂至恒重）

C解為解析液中黃酮濃度，（mg/mL）；V解為解析液的體積，mL；C初為黃酮提取液原始濃度，（mg/mL）；C殘為柱層析后剩余樣液中黃酮濃度，（mg/mL）；V上為上柱用提取液體積，mL。

1.2.5 AB-8樹脂對荷葉黃酮的動態(tài)吸附實驗

1.2.5.1 不同吸附流速對吸附效果的影響[10-11]

荷葉黃酮提取液（C初=1.82mg/mL，V=100mL）分別以2、3、4BV/h的流速通過AB-8樹脂吸附柱，本著以泄漏點最遲出現(xiàn)的原則選擇最佳吸附流速。

在精制色素溶液的過程中，當該處泄漏液的吸光度值為上柱前樣液吸光度值的1/10時，確定為泄漏點。本研究中，因黃酮溶液濃度與吸光值不成正比關(guān)系，所以需通過計算，當該處溶液的黃酮濃度值為上柱前樣液黃酮濃度值的1/10時，確定該處為泄露點。

1.2.5.2 不同上樣濃度對吸附效果的影響

將100mL C初分別是1.24、1.86、2.08、2.79mg/mL的荷葉黃酮提取液以3 BV/h的吸附流速，通過已經(jīng)處理好的裝有一定AB-8大孔樹脂的吸附柱，優(yōu)化上樣濃度，以泄漏點出現(xiàn)最遲的上樣濃度為宜。

1.2.5.3 不同上樣液pH對吸附效果的影響

分別將100mLpH為4、6、8的濃度均為2.08mg/mL的荷葉黃酮溶液，以3BV/h的吸附流速通過已經(jīng)處理好的裝有一定AB-8大孔樹脂的吸附柱，優(yōu)化上樣液pH，以泄漏點最遲出現(xiàn)的上樣液pH為宜。

1.2.6 AB-8樹脂對荷葉黃酮的動態(tài)洗脫實驗

1.2.6.1 確定解析劑濃度

用荷葉黃酮提取液對進行預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂吸附，達到泄漏點后，用去離子水洗樹脂柱至流出液無色，然后用3 BV不同濃度的乙醇溶液以1.5 BV/h的流速對AB-8樹脂柱進行解析，分別合并用不同濃度的乙醇溶液解析情況下的濃組分，測定其吸光值。

1.2.6.2 確定解析劑用量

用AB-8樹脂柱吸附荷葉黃酮提取液直至泄漏點出現(xiàn)，水洗至流出液為無色。然后用不同量的80%乙醇溶液解析吸附過的樹脂，解析流速為1.5 BV/h，分別合并不同洗脫情況下解析液的濃組分，測定其吸光值。

1.2.6.3 選擇不同的解析流速

用AB-8樹脂柱吸附荷葉黃酮提取液直至泄漏點出現(xiàn)，水洗至流出液為無色。然后用80%乙醇溶液分別以1、1.5、2 BV/h的解析流速對樹脂柱進行解析，解析劑用量均為3 BV，分別收集每種情況下的洗脫液。各管收集10mL解析液，計算其黃酮濃度。

1.2.6.4 選擇不同的吸附-洗脫pH

分別調(diào)荷葉黃酮溶液的pH為4、6、8，使其分別通過AB-8樹脂柱，吸附流速均為3BV/h。然后用80%乙醇洗脫AB-8樹脂柱，解析流速為1.5 BV/h。每管收集10mL解析液，計算流出液黃酮濃度。

1.2.7 荷葉黃酮產(chǎn)品得率純度的計算[14]

1.2.7.1 計算提取液中荷葉黃酮純度

式中：c為提取液黃酮濃度，（mg/mL）；w為荷葉樣品質(zhì)量，mg；V為黃酮溶液體積，（mg/mL）。

1.2.7.2 計算上柱前提取液黃酮純度

式中：m為提取液黃酮質(zhì)量，g；n為提取液干燥后固形物質(zhì)量，g。

1.2.7.3 計算產(chǎn)品中荷葉黃酮純度

式中：p為總黃酮質(zhì)量，g；q為產(chǎn)品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8樹脂對總黃酮的靜態(tài)吸附率與解吸率測定結(jié)果

根據(jù)1.2.4中的方法和公式，計算得AB-8型樹脂對荷葉黃酮的基本飽和吸附量為96.01mg/g，洗脫率為92.72%。

2.2 AB-8樹脂對荷葉黃酮的動態(tài)吸附實驗結(jié)果

2.2.1 不同吸附流速對吸附效果的影響

按照1.2.5.1中的方法，分別考察吸附流速為2、3 BV/h及4BV/h時的樹脂的吸附效果見圖1。

圖1 吸附流速對AB-8樹脂吸附作用的影響Fig.1 The effect of adsorption velocity on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖1和計算可得，2 BV/h、3 BV/h及4 BV/h三種流速分別在80、70、50mL附近出現(xiàn)泄漏點。吸附流速越慢，泄漏點出現(xiàn)越遲。這是由于較慢的吸附流速可使荷葉黃酮樣液充分接觸樹脂，吸附效果好。若流速過快，會使AB-8樹脂還沒充分吸附荷葉黃酮，已隨吸附液流出。所以較慢的吸附流速利于提高吸附效果。但流速過慢，會降低吸附效率。因此選用吸附流速為3BV/h。

2.2.2 不同上樣濃度對吸附效果的影響

按照1.2.5.2中的方法，考察上樣濃度對AB-8型樹脂吸附效果的影響（圖2），C初分別是1.24、1.86、2.08、2.79mg/mL。

由圖2可得，C初分別是1.24、1.86、2.08、2.79mg/mL的荷葉黃酮提取液通過樹脂柱，吸附流速為3 BV/h，泄露點分別出現(xiàn)在60、70、70、40mL附近。得出若初始濃度過低，則樹脂吸附效率較低。若樣初始濃度過大，則泄露點出現(xiàn)較早，吸附量較低。由圖2可知，C初為1.86mg/mL和2.08mg/mL的樣液上柱，樹脂吸附效果較好?？紤]到在泄露發(fā)生情況相同的條件下，樣液黃酮初始濃度越高，AB-8型樹脂的吸附量和吸附率則越大，所以確定樣液上樣濃度為2.08mg/mL。

圖2 上樣液濃度對AB-8型樹脂吸附作用的影響Fig.2 The effect of initial concentration on the adsorption impact of AB-8resin

2.2.3 不同上樣液pH對吸附效果的影響

按照1.2.5.3中的方法，分別考察pH為4、6、8時上樣液pH對AB-8樹脂吸附效果的影響見圖3。

圖3 上樣液pH對AB-8樹脂吸附作用的影響Fig.3 The effect of pH on the adsorption impact of AB-8 resin

由圖3得，調(diào)樣液pH分別為4、6、8，經(jīng)AB-8型樹脂吸附后，分別在60、70、50mL處發(fā)生泄露現(xiàn)象。由于荷葉黃酮為多酚性物質(zhì)，含羥基較多，水溶液呈弱酸性；若吸附原液為酸性，則-OH上質(zhì)子電離會收到抑制作用，AB-8樹脂吸附能力下降，吸附飽和時間延長。若吸附原液為堿性，質(zhì)子與堿反應(yīng)，削弱AB-8樹脂與吸附液進行氫鍵吸附的能力，甚至沒有飽和就已經(jīng)泄漏了。因此，在酸性條件下荷葉黃酮以分子的狀態(tài)存在，吸附效果好。從吸附量和吸附率考慮，pH為6的條件利于提高樹脂吸附效果。

2.3 AB-8樹脂對荷葉黃酮的動態(tài)解析實驗

2.3.1 確定洗脫劑濃度

選擇合適解吸劑時應(yīng)考慮溶解吸附質(zhì)效果好，同時應(yīng)具備低沸點，易回收，利于環(huán)保等問題。因此最好選用極性有機溶劑乙醇作為解析劑，其低沸點且水溶性較好[12]。根據(jù)1.2.6.1中方法，采用不同濃度乙醇對已吸附飽和的樹脂進行解析，其影響結(jié)果見表1和圖5。

表1 不同濃度乙醇的動態(tài)解析Table1 The desorption effect of different concentration of ethanol

由表1得，較高的乙醇濃度對樹脂動態(tài)解析效果有利，其中，80%乙醇和90%的乙醇溶液動態(tài)解析效果相近。分別選用60%、70%、80%的乙醇作為洗脫劑進行解析，分別收集每種洗脫液，每管10mL，測定吸光值，計算濃度。這三種乙醇濃度的洗脫情況見圖4。

圖4 濃度乙醇濃度對解析效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption performance

由圖4可得，高濃度乙醇能快速洗脫濃組分。用80%的乙醇溶液動態(tài)解析荷葉黃酮，洗脫速度快，且洗脫峰峰形集中。而用60%和70%的乙醇進行動態(tài)解析，洗脫曲線峰形較寬且峰形拖尾現(xiàn)象較嚴重。所以確定乙醇溶液濃度為80%。

2.3.2 確定解析劑用量

在保證吸附物充分被解析的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量節(jié)省解析劑的用量。通常解析劑用量是用樹脂柱床體積的倍數(shù)來表達。按照1.2.6.2中方法，考察不同解析劑用量對AB-8樹脂洗脫效果的影響，結(jié)果見表2。

表2 80%乙醇的用量對洗脫效果的影響Table2 The desorption effect of different dosage of 80%ethanol

由表2可得，當80%乙醇的用量越大，解析效果越好。鑒于乙醇用量分別為4、5 BV和6 BV時，解析液濃組分的總吸光值增加幅度較小，為節(jié)省解析劑用量，所以洗脫劑乙醇的適宜用量為3BV。

2.3.3 選擇不同解析流速

一般要求解析流速較慢。若采用較快解析流速會產(chǎn)生一些問題，如吸附物不能較完全解析，洗脫峰峰形較寬，會產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象等。但是若采用過較慢解析流速，則會延長解析時間。因而常把解析流速確定為吸附流速的1/3～1/2[13]。因而本實驗采用解析流速分別為1、1.5、2BV/h，均為本實驗吸附流速的1/2來考察。

按照1.2.6.3中的方法，比較不同解析流速對洗脫效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 解析流速的選擇對洗脫效果的影響Fig.5 Effect of different desorption velocity on desorption performance

由圖5可得，解析流速為1 BV/h時，峰值低、峰形寬且拖尾嚴重。當解析流速為2BV/h時，峰值高、峰形集中。整體來看，無論從洗脫峰峰形和峰值還是拖尾現(xiàn)象是否嚴重情況來看，解析流速為2 BV/h與解析流速為1.5BV/h時的洗脫效果相差不明顯?？紤]到其二者分別對應(yīng)的吸附流速所產(chǎn)生的吸附情況有所差異，v吸附為3 BV/h時比v吸附為4 BV/h時泄漏點晚出現(xiàn)20 mL，所以選擇v吸附為3 BV/h，v解析為1.5 BV/h。

2.3.4 選擇不同的吸附-洗脫pH

按照1.2.6.4中的方法，比較吸附原液不同pH對洗脫效果的影響，選定荷葉黃酮溶液pH分別為4、6、8，結(jié)果見圖6。

圖6 不同吸附原液pH對洗脫效果的影響Fig.6 Effect of different pH on desorption performance

由圖6可知，當荷葉黃酮溶液pH為6時，洗脫峰峰值高，峰形窄，基本無拖尾現(xiàn)象。洗脫效果最好?？梢缘贸?，AB-8大孔樹脂對黃酮類物質(zhì)的吸附-洗脫工作過程存在一個最佳pH。若pH過高，使AB-8樹脂與樣液的較弱產(chǎn)生氫鍵吸附作用，在吸附物解析時產(chǎn)生洗脫峰峰值低峰形寬等現(xiàn)象；若pH過低，黃酮則會與樹脂結(jié)合較牢固，不利于洗脫，峰值低，且拖尾嚴重。所以最合適吸附-洗脫pH為6。

2.4 產(chǎn)品得率純度計算

根據(jù)1.2.7中的公式及計算方法，得出荷葉經(jīng)超聲波粉碎技術(shù)處理，提取液中黃酮得率為5.35%；用AB-8大孔樹脂處理前濃縮樣液中的黃酮含量為16.52%；經(jīng)AB-8大孔樹脂分離純化后得到的產(chǎn)品中荷葉黃酮含量為59.31%。

3 結(jié)論

經(jīng)過研究AB-8大孔樹脂對的吸附和解吸特性，得到最佳吸附-解析條件，即選擇AB-8大孔吸附樹脂為吸附劑，v吸附流速=3 BV/h，c吸附原液=2.08mg/mL，pH= 6；解析劑選擇乙醇溶液，c乙醇=80%，v洗脫流速=1.5BV/h，V洗脫劑用量=3BV。經(jīng)過該條件的分離提純。產(chǎn)品中荷葉黃酮的純度為純化前荷葉黃酮純度的3.59倍，而是荷葉黃酮粗提液純度的11.09倍，提高了10倍之多。本研究表明荷葉總黃酮的富集可通過AB-8大孔樹脂得以實現(xiàn)，工藝條件溫和，分離效果較好。

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Study on Separation and Purification of Total Flavones from Lotus Leaf by AB-8 Macroporous Resin

ZHANG Lei1，LI Mei-xiang1，WU Xiu-ling1，QIAO Xu-guang2，*
（1.College of Food Science and Technology，Jinan 272000，Shandong，China；2.Shandong Agricultural University，Taian 271018，Shandong，China）

The isolation ability of AB-8 macroporous adsorption resin for total flavones of lotus leaf was studied by examining the characteristics of adsorption and desorption.The result showed that the AB-8 resin possesses higher absorption and desorption capacity.The optimum conditions were as follows：the best adsorption process is vadsorption=3 BV/h，cadsorption=2.08mg/mL pH=6；the best desorption process is using 80% ethanol as the elution solvent，1.5BV/h flow rate，within 3 BV the flavonoids can be eluted completely.The product yield can be 59.31% by refinement of flavonoids from lotus leaf.

lotus leaf；flavonoids；macroporous resins；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.011

2013-03-04

張蕾（1981—），女（回），講師，研究生，主要從事功能食品研究。

*通信作者：喬旭光，教授。