順式二苯乙烯苷的制備及結構鑒定

董立華，郭盼盼，郭 棟，閆文英，王春英*

(1.河北醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017；2.華北制藥集團公司新藥研究開發(fā)中心，河北 石家莊 050010)

苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)為蓼科植物何首烏中的主要成分，它具有抗氧化、降血脂、抑制骨質疏松[1]、抑制血管內皮細胞過度增生[2]、神經(jīng)保護[3]、心肌保護[4]、改善動脈硬化及加速血流[5]等作用。從結構上看，THSG存在順反異構體，在自然條件下主要以反式二苯乙烯苷(trans-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，trans-THSG)存在，有實驗[6]表明在光照的誘導下反式結構可以轉化成順式二苯乙烯苷(cis-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，cis-THSG)。許多藥物因為異構體的存在而顯示出不同的藥理活性，然而以往對何首烏中二苯乙烯苷的探索都是以trans-THSG為研究對象而忽視了cis-THSG的存在。為了進一步對cis-THSG進行體內外的深入研究，首先要獲得足夠量的cis-THSG及其純品。由于cis-THSG沒有市售的對照品，且何首烏藥材中cis-THSG的含量很少，通過分離提取也很難獲得。本研究旨在通過優(yōu)化光催化作用的條件，使trans-THSG轉變成cis-THSG，采用制備液相技術[7]獲得cis-THSG的純品(≥98.0%)，并以四大光譜聯(lián)用進行結構鑒定。

1 儀器與試藥

3200 QTRAP 型串聯(lián)四級桿線性離子阱質譜儀，配有Turbo V離子源(美國AB公司)，紫外分光光度計TU-1901(北京普析通用儀器有限責任公司)，磁共振儀(美國Bruker公司)，紅外分光光度計FTIR-8400S(日本島津)，高效液相色譜儀(美國Agilent 1200，二極管陣列檢測器)，紫外燈250 W-L 130 mm(北京中瑞達電光源廠)，LG16-B型離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)，冷凍干燥機(德國Christ公司)。

trans-THSG對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號0844-1005)，trans-THSG(本研究室從何首烏中分離提取，經(jīng)測定純度為98.5%)，色譜甲醇(J.T.-Baker)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：色譜柱 Diamonsil C18柱(分析250mm×4.6mm,5μm；制備250mm×10.0mm,5μm；預柱7.6mm×4.6mm，5μm)；流動相甲醇(A)-水(B)，梯度程序如下，0～1min、5%～30% A，1～10min、30%～72% A，10～11min、72%～95% A，11～14min、保持95% A；每次進樣前先以5% A預平衡10min；檢測波長285nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃；分析進樣量20μL，制備進樣量100μL。結構圖見圖1，色譜圖見圖2。

圖1 trans-THSG和cis-THSG的化學結構

圖2 高效液相色譜圖

2.2 轉化條件的考察

2.2.1 光照條件的選擇：精密稱定trans-THSG適量于量瓶中，用水溶解并稀釋成濃度為0.1g/L的溶液。分別精密量取9份相同體積的溶液于大小形狀都相同的小燒杯中，各取3份分別在日光、254nm紫外光和365nm紫外光下照射，20min后取出放冷，用水補足失重，搖勻，以14 000r/min離心10min，取上清液分別注入液相色譜儀進行測定。根據(jù)各組cis-THSG的峰面積平均值進行分析，結果表明，trans-THSG在254nm紫外燈下照射幾乎沒有轉化，在日光下照射轉化率較少，而在365nm紫外燈下照射時的轉化率最大，因此選擇365nm紫外光照射。

2.2.2 溶劑的選擇：分別用水和甲醇為溶劑配制濃度為0.1g/L的trans-THSG溶液，在365nm紫外燈下照射20min，取出放冷后分別用水和甲醇補足減失的質量，搖勻，以14 000r/min離心10min，取上清液，用水稀釋后分別注入液相色譜儀進行測定，根據(jù)cis-THSG的峰面積進行統(tǒng)計分析。結果表明，溶劑為水和甲醇時，其峰面積差異無統(tǒng)計學意義。由于甲醇毒性比較大，且甲醇為溶劑進行色譜分離時存在較強的溶劑效應，因此我們最終選擇了以水作溶劑進行轉化。

2.2.3 初始濃度及光照時間的選擇：配制trans-THSG的系列濃度水溶液，0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L，每個濃度6份，分別在365nm紫外燈下照射5、10、15、20、25、30min，取出放冷，用水補足失重，搖勻，按trans-THSG的初始濃度計，各溶液稀釋至相同濃度，以14 000r/min離心10min，取上清液注入高效液相色譜儀進行測定，記錄cis-THSG的峰面積，間接評價轉化率的高低。結果表明，低濃度時隨著光照時間的延長，轉化率越來越低(圖3A)，而高濃度時隨著光照時間的延長，轉化率越來越高(圖3B)。為了比較各溶液中cis-THSG的濃度高低，我們用峰面積乘以稀釋倍數(shù)作為各轉化后溶液的表觀峰面積(圖4)。通過對圖3，4綜合分析，初始濃度為6.0g/L，照射時間為20min時，具有較高的轉化率和制備效率。

2.3 cis-THSG的制備：稱取trans-THSG，用水溶解成濃度為6.0g/L的溶液，在365nm紫外燈下照射20min，以14 000r/min離心10min，取上清液注入液相色譜儀進行分離制備。分別收集cis-THSG和trans-THSG的流分，前者經(jīng)50℃減壓蒸餾，剩余物用水溶解后冷凍干燥得白色固體粉末(cis-THSG)。避光密封保存于-20℃冰箱中備用。后者按相同方法回收后，重復上述方法進行轉化，分離。

2.4 結構鑒定：質譜條件，源噴射電壓-4 500V，氣簾氣1.03×105Pa，霧化氣1.03×105Pa，解簇電壓 (DP)-38V(trans-THSG和cis-THSG)，碰撞電壓 (CE) -48 eV (trans-THSG和cis-THSG)。分別取trans-THSG和cis-THSG適量，50%甲醇溶解，針泵進樣，分別得到一級、二級質譜圖(圖5)，由圖中可知，cis-THSG與trans-THSG具有相同的準分子離子m/z 405.1[M-H]，表明二者具有相同的分子量。對準分子離子m/z 405.1[M-H]進行二級質譜掃描，得到相同的丟失一個糖基的碎片離子m/z 243.1[M-C6H11O5]及其他相同的碎片離子，如m/z 225.1、173.0、145.2、137.1和109.0，表明二者具有相同的裂解規(guī)律。

圖3 初始濃度及光照時間對轉化率的影響

A.低濃度；B.高濃度

Figure 3 Effect of incipient concentration and illumination time on conversion

A.Low concentration;B.High concentration

圖4 各濃度下表觀峰面積隨時間的變化

Figure 4 Changes in the concept of apparent peak area of each concentration with time

圖5 質譜圖

A.trans-THSG一級質譜圖；B.cis-THSG一級質譜圖；C.trans-THSG二級質譜圖；D.cis-THSG二級質譜圖

Figure 5 Mass spectra

A.First order mass spectrum of trans-THSG;B.First order mass spectrum of cis-THSG;C.Second order mass spectrum of trans-THSG;C.Second order mass spectrum of cis-THSG

核磁共振數(shù)據(jù)及歸屬如下：1H-NMR[500 MHz,CD3OD]δ，3.20(m,1H,C2″-H),3.38 (dd,J=9.0 Hz,1H,C5″-H),3.45 (t,J=9.0 Hz,1H,C4″-H),3.48 (t,J=9.0Hz,1H,C3″-H),3.69-3.79(m,2H,C6″-H),4.57 (d,J=8.0Hz,1H,C1″-H),6.14 (d,J=3.0Hz,1H,C4-H),6.23(d,J=3.0Hz,1H,C6-H),6.48 (d,J=12.0 Hz,1H,β-H),6.61(d,J=8.5Hz,2H,C3′,5′-H),6.72 (d,J=12.0Hz,1H,α-H),7.06 (d,J=8.5 Hz,2H,C2′,6′-H)。其中δ 6.48(d,1H) 和6.72(d,1H) 的耦合常數(shù)為12.0Hz，與反式耦合常數(shù)16.5 Hz不同，可以說明這兩個不飽和碳上的質子信號為順式雙鍵質子信號。

13C-NMR[125MHz,CD3OD]δ：62.2 (C6″),71.0 (C4″),75.4(C2″),77.9(C3″),78.3(C5″),103.7 (C1″),107.6(C4),108.2(C6),115.9(C3′,C5′),125.5(C1),129.8 (Cα),131.3(C1′),131.4 (C2′,C6′),133.9(Cβ),137.8(C2),151.8(C5),155.3(C3),157.7(C4′)。

紫外全掃描圖譜結果顯示其最大吸收波長由trans-THSG的320nm移至285nm處(圖6)，與文獻報道一致[8]。

圖6 紫外掃描光譜 (50mg/L水溶液)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

Figure 6 UV scanning spectra (50mg/L aqueous solution)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

紅外光譜數(shù)據(jù)(KBr,cm-1):3 500和3 200 (νO-H)，2 924和2 885 (νC-H)，1 609和1 514(νC-C)，1 456(δC-H)，690 (γ=C-H) 其中690cm-1為順式烯烴面外振動的標志，而反式烯烴的面外振動在970cm-1。

根據(jù)上述四大光譜解析，可知制備得到的化合物即為目標化合物cis-THSG。

3 討 論

3.1 轉化條件的總體分析：本研究結果表明，低濃度時隨著光照時間的延長，trans-THSG轉化為cis-THSG的轉化率越來越低，而高濃度時隨著光照時間的延長，轉化率越來越高；而各溶液中trans-THSG的量均隨時間呈下降趨勢。其原因可能與苷類化合物降解有關，且符合濃度越小越容易發(fā)生降解的普遍規(guī)律。雖然在色譜圖中觀察不到明顯的降解物峰，但是很可能會影響目標物峰的純度，轉化時間也不易過長。因此在保證一定的轉化率和制備效率的同時，轉化時間越短越好。

3.2 展望：天然存在于何首烏中的二苯乙烯苷大多為反式結構，順式含量僅有5.985%，本研究結果表明其在光照條件下可發(fā)生順反異構而轉化為順式結構，今后應對cis-THSG的生物活性、毒性等加以研究，以期更合理地評價光致異構對二苯乙烯苷用藥有效性和安全性的影響。

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