母豬飼糧中添加精氨酸對仔豬腸道免疫細(xì)胞數(shù)量的影響

寇 濤 呂 佳琪 李 偉 王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

仔豬初生重是后天生長發(fā)育的一項(xiàng)重要指標(biāo)，宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine grow th retardation，IUGR)可多方面影響出生后的生長發(fā)育。腸道是動物消化吸收的主要場所，也是體內(nèi)最大的免疫器官，因此增強(qiáng)仔豬腸道免疫功能是提高機(jī)體抗病力、促進(jìn)仔豬健康發(fā)育的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加酶制劑、酸化劑、中草藥、寡糖和谷氨酰胺等營養(yǎng)物質(zhì)可改善仔豬腸道環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［1－2］。精氨酸(Arg)具有重要的生理代謝和營養(yǎng)作用，在促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和細(xì)胞分裂等生理過程中具有重要的作用，并且Arg是幼齡哺乳動物達(dá)到最大生長性能所必需的一種氨基酸［3－4］。而豬胚胎在宮內(nèi)發(fā)育過程中處于Arg營養(yǎng)缺乏狀態(tài)。Wu等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸氮在羊水、尿囊液中占總氮的比例很高，這提示Arg代謝在宮內(nèi)營養(yǎng)中占有重要地位。有報(bào)道稱Arg強(qiáng)化的腸內(nèi)營養(yǎng)可增加腸黏膜厚度及小腸絨毛數(shù)量，降低腸黏膜的通透性，減少腸道細(xì)菌易位的機(jī)會［6］。但目前有關(guān)于Arg的母體效應(yīng)對IUGR仔豬空腸及回腸內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量的研究報(bào)道不多，因此，本試驗(yàn)通過在妊娠母豬飼糧中添加1%Arg測定其后代中IUGR仔豬的生長性能、小腸中免疫細(xì)胞的數(shù)量來研究Arg的母體效應(yīng)對IUGR仔豬腸道的調(diào)控作用，為該方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物、飼養(yǎng)管理及分組

本試驗(yàn)選取妊娠母豬(長白×大白，試驗(yàn)開始于妊娠30 d)20頭，隨機(jī)分2組飼養(yǎng)，分別為基礎(chǔ)飼糧組和基礎(chǔ)飼糧添加1%Arg組，每組10頭母豬，母豬單欄飼養(yǎng)，自由采食。待母豬產(chǎn)后，從基礎(chǔ)飼糧組母豬所生產(chǎn)仔豬中選8頭正常初生重母豬和8頭IUGR母豬，分別為對照組和IUGR組，從基礎(chǔ)飼糧添加1%Arg組母豬所生產(chǎn)仔豬中選8頭IUGR母豬，為Arg+IUGR組，共3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭仔豬，各組仔豬隨母豬哺乳至屠宰。IUGR仔豬選擇標(biāo)準(zhǔn)為初生重低于平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。母豬基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水見表1。

表1 母豬基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for sow s(air-dry basis) %

1.2 樣品采集

仔豬在屠宰前(7及21日齡)進(jìn)行稱重，每組各選取4頭仔豬進(jìn)行屠宰。屠宰前12 h停食，隨后頸動脈放血致死，迅速打開腹腔，取出腸道，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，從小腸中分離出空腸和回腸。在各段腸道1/2處取1.5 cm的腸段并用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定。

1.3 腸道組織形態(tài)學(xué)觀察

1.3.1 制作石蠟切片

組織樣用多聚甲醛固定24 h后，制作石蠟切片。組織切片程序?yàn)?取材固定8～12 h→修樣→洗滌→70%酒精脫水45～60 m in→85%酒精脫水45～60 m in→95%酒精脫水45～60 m in→100%酒精脫水2次→透明(二甲苯15～20 m in)2次→透蠟3次，各40 m in→包埋→切片→貼片→烤片。

1.3.2 石蠟切片染色

1.3.2.1 阿利新蘭－高碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色

染色程序?yàn)?切片脫蠟至水→入0.5%～1.0%高碘酸水溶液氧化5 m in→蒸餾水速洗1次→Schiff氏液染色30～60 m in→經(jīng) Schiff氏液后，以亞硫酸水洗2～3次，每次約30 s至1m in→蒸餾水速洗2次→蘇木精復(fù)染核→蘇木精復(fù)染色后，經(jīng)0.5%鹽酸酒精溶液分色(5～10 s)，以鏡檢為準(zhǔn)，用自來水藍(lán)化→經(jīng)95%酒精及其無水酒精脫水，各1～2 m in→二甲苯透明→中性樹膠封固。ABPAS染色主要用于觀察杯狀細(xì)胞。

1.3.2.2 甲苯胺藍(lán)染色

染色程序?yàn)?切片脫臘至水→蒸餾水浸洗3次→切片從水中取出，甲苯胺藍(lán)液浸染30 s→蒸餾水浸洗(洗凈甲苯胺藍(lán)染液為止)→95%酒精分色，在鏡下觀察控制→100%酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封固。甲苯胺藍(lán)染色主要用于觀察肥大細(xì)胞。

1.3.3 腸道免疫細(xì)胞的觀察與計(jì)數(shù)

在Nikon ECLIPSE－80i和Olympus BX－51顯微鏡光鏡下分別詳細(xì)觀察和檢測每組的空腸和回腸黏膜上皮肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量和分布。具體檢測方法是:1)統(tǒng)計(jì)觀察每根腸管橫斷面的腸壁全層，包括黏膜及黏膜下層、肌層及漿膜層的肥大細(xì)胞數(shù)量和分布;2)取每根腸管橫斷面，統(tǒng)計(jì)觀察5根最長且排列整齊的絨毛，計(jì)數(shù)每100個(gè)腸黏膜上皮柱狀細(xì)胞間內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)量和分布。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行組間方差分析和多重比較。以P＜0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以 P＜0.01作為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 母豬飼糧中添加Arg對仔豬平均日增重的影響

在整個(gè)試驗(yàn)期間各組均無仔豬死亡。由表2可知，Arg+IUGR組仔豬初生重極顯著低于對照組和 IUGR 組(P＜0.01)，但 Arg+IUGR 組與 IUGR組仔豬7及21日齡體重差異不顯著(P＞0.05);IUGR組和Arg+IUGR組仔豬1～7日齡平均日增重均顯著低于對照組(P＜0.05);各組仔豬8～21日齡及1～21日齡平均日增重均差異不顯著(P＞0.05)，且Arg+IUGR組仔豬平均日增重高于 IUGR 組，分別比 IUGR 組提高14.29%和10.53%，但差異不顯著(P＞0.05)。

表2 母豬飼糧中添加Arg對仔豬平均日增重的影響Table 2 Effects of sow diet supplemented w ith Arg on average daily gain of piglets

2.2 母豬飼糧中添加Arg對腸道黏膜免疫細(xì)胞的影響

2.2.1 小腸黏膜上皮肥大細(xì)胞的數(shù)量分布變化

由表3可知，對于7日齡仔豬，Arg+IUGR組空腸肥大細(xì)胞數(shù)量極顯著高于對照組和IUGR組(P＜0.01)，分別提高 94.29%和 140.40%;各組回腸肥大細(xì)胞數(shù)量差異不顯著(P＞0.05)，Arg+IUGR組較IUGR組肥大細(xì)胞數(shù)量有所提高，但低于對照組(P＞0.05)。

對于21日齡仔豬，Arg+IUGR組空腸肥大細(xì)胞數(shù)量較對照組和IUGR組分別提高45.09%和50.46%，差異顯著(P＜0.05)，但對照組和 IUGR組之間差異不顯著(P＞0.05);回腸肥大細(xì)胞數(shù)量各組間差異不顯著(P＞0.05)，但 Arg+IUGR組的細(xì)胞數(shù)量比對照組和IUGR組有所提高。

表3 仔豬小腸黏膜上皮肥大細(xì)胞數(shù)量Table 3 The number of intestinalmucosa epithelialmast cells of piglets 個(gè)/1 000μm2

圖1中箭頭所指細(xì)胞為上皮內(nèi)肥大細(xì)胞，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，肥大細(xì)胞呈紫紅色;形狀多樣，有圓形、橢圓形或梭形，大小不一。胞漿內(nèi)顆粒豐滿，部分細(xì)胞呈脫顆粒狀。

圖1 各組7日齡仔豬空腸及回腸黏膜上皮肥大細(xì)胞Fig.1 The jejunum and ileum mucosamast cells of piglets at 7 days of age in each group(×40)

2.2.2 小腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量分布變化

由表4可知，對于7日齡仔豬，IUGR組空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組(P＜0.05)，Arg+IUGR組與IUGR組相比杯狀細(xì)胞數(shù)量提高了37.76%，但差異不顯著(P＞0.05);Arg+IUGR 組回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量極顯著高于IUGR組(P＜0.01)，并且提高至與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

對于21日齡仔豬，Arg+IUGR組空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，但與IUGR組相比得到顯著提高(P＜0.05)。Arg+IUGR組回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于IUGR組(P＜0.05)，也高于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。

表4 仔豬小腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量Table 4 The number of intestinalmucosa epithelial goblet cells of piglets 個(gè)/100 columnar cells

圖2中箭頭所指細(xì)胞為上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞散在分布于柱狀細(xì)胞之間，一般靠近腸腺部位分布集中。杯狀細(xì)胞排列緊密，靠近絨毛頂端的杯狀細(xì)胞呈散在分布;經(jīng)AB-PAS染色后杯狀細(xì)胞呈紫紅色，高腳杯狀。

圖2 各組7日齡仔豬空腸及回腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞Fig.2 The jejunum and ileum mucosa epithelial goblet cells of piglets at7 days of age in each group(×40)

3 討論

3.1 母豬飼糧中添加Arg對仔豬平均日增重的影響

新生仔豬的胃腸道在短期內(nèi)迅速發(fā)育，但I(xiàn)UGR仔豬消化器官的發(fā)育程度普遍不及正常仔豬，IUGR后代的消化器官較小，并伴有消化系統(tǒng)功能障礙，常造成生長緩慢或死亡［7－8］。Arg對于幼齡仔豬是一種必需氨基酸，Arg缺乏是限制哺乳仔豬獲得最佳生長性能的主要因素。但內(nèi)源合成的Arg不能使早期斷奶的仔豬達(dá)到最佳生長性能，Arg的供應(yīng)可能會促進(jìn)新生仔豬的生長性能達(dá)到最佳［9］。研究表明在哺乳母豬飼糧中分別添加0.80%Arg 和 0.03%、0.06%精氨酸生素降低了母豬血漿尿素氮含量，提高了仔豬斷奶窩重和斷奶均重［10］。

Mateo等［11］發(fā)現(xiàn)在妊娠 30～114 d的母豬飼糧中添加1%Arg可以防止IUGR的發(fā)生，從而使活仔數(shù)增加22%，窩產(chǎn)平均活仔數(shù)從9.37頭提高到11.40頭。而王琤［12］在妊娠期母豬飼糧中添加1%Arg后能有效提高初生仔豬窩產(chǎn)活仔數(shù)和成活率。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Arg+IUGR組仔豬初生重極顯著低于IUGR組與對照組，這可能是由于Arg的母體效應(yīng)提高了母豬窩產(chǎn)仔豬數(shù)，導(dǎo)致妊娠期間IUGR仔豬通過胎盤獲得母體營養(yǎng)相對減少，從而加劇了IUGR仔豬的營養(yǎng)不良，導(dǎo)致初生重顯著降低。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示Arg+IUGR組仔豬在7和21日齡體重提高至與IUGR組差異不顯著;并且8～21日齡、1～21日齡的平均日增重3組間差異不顯著，尤其與對照組差異不顯著，這提示Arg的母體效應(yīng)對IUGR的發(fā)育具有補(bǔ)償生長的作用。Arg的母體效應(yīng)對仔豬組織器官發(fā)育造成影響的同時(shí)，亦可能改變仔豬的代謝程序化模式，有研究發(fā)現(xiàn)母豬妊娠期營養(yǎng)素水平顯著影響了子代豬血清胰島素樣生長因子－Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生長激素、瘦素、胰島素等激素水平。而Arg可促進(jìn)胰島素、生長激素、泌乳素和IGF-Ⅰ的分泌，這些激素參與了Arg對仔豬免疫功能的調(diào)節(jié)作用［13］。并且飼喂Arg的母豬妊娠期間產(chǎn)生的IGF-Ⅰ可以增加仔豬的體重并且增強(qiáng)胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，通過影響胎盤的活性改變仔豬的生長發(fā)育。Arg的母體效應(yīng)可能通過影響IGF-Ⅰ及IGF-Ⅰ受體 mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工而提高產(chǎn)后IUGR仔豬IGF-Ⅰ基因的表達(dá)及增加可與IGF-Ⅰ結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的受體的量，通過IGFs家族的協(xié)同作用，對仔豬補(bǔ)償生長起促進(jìn)作用［14］。此外，Arg也參與了DNA的甲基化過程，從而影響印記基因的甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致印記基因胰島素樣生長因子－Ⅱ(IGF-Ⅱ)在IUGR仔豬體內(nèi)表達(dá)水平升高，促進(jìn)了Arg+IUGR組IUGR后天的補(bǔ)償生長。這可能是Arg的母體效應(yīng)導(dǎo)致IUGR仔豬發(fā)生補(bǔ)償生長的原因，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

3.2 母豬飼糧中添加Arg對仔豬腸道免疫細(xì)胞數(shù)量的影響

腸道的屏障功能主要由腸黏膜屏障來實(shí)現(xiàn)的，包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障、免疫學(xué)屏障和腸黏膜固有層篩等部分［15］。Gaskins［16］報(bào)道，腸上皮細(xì)胞是仔豬抵抗飼料毒素及外來致病菌的第一道防線，其表面含有毒素及細(xì)菌受體，且包含具有一定免疫功能的淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。Ziegler等［17］發(fā)現(xiàn)仔豬斷奶前腸道的發(fā)育主要依賴細(xì)胞的增殖。而IUGR會導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞凋亡增多，造成腸道生長和形態(tài)發(fā)生改變。由于Arg及其代謝產(chǎn)物如一氧化氮，在免疫防御和調(diào)節(jié)、腸道黏膜功能的保護(hù)以及腫瘤特異性免疫等方面發(fā)揮著重要作用，因此可將Arg添加到飼糧中以提高動物的免疫功能。

肥大細(xì)胞是抗感染免疫的第一線細(xì)胞，能通過所分泌的細(xì)胞因子參與獲得性免疫，是重要的免疫活性細(xì)胞［16，18］。杯狀細(xì)胞可通過特異性免疫機(jī)制和非特異性免疫機(jī)制參與并調(diào)節(jié)腸道局部免疫機(jī)能，它能分泌一種酸性物質(zhì)到達(dá)黏膜表面，從而形成一層保護(hù)膜而發(fā)揮屏障作用［19］。因此，肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞在IUGR仔豬腸道免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)中起重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Arg的母體效應(yīng)主要影響空腸肥大細(xì)胞的數(shù)量，可顯著提高IUGR仔豬的空腸肥大細(xì)胞數(shù)量，并且細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組。這說明提高妊娠母豬飼糧中的Arg水平可以顯著提高腸道中肥大細(xì)胞的數(shù)量，從而改善IUGR仔豬的腸道免疫功能。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)與IUGR組相比，Arg+IUGR組仔豬7日齡回腸、21日齡空腸及回腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著提高，而7日齡空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量與IUGR組相比無顯著差異，但有所提高，這可能是由于初生和哺乳階段IUGR仔豬腸道內(nèi)極低的精氨酸酶活性使仔豬腸細(xì)胞對Arg的代謝能力有限所致［20］。Arg+IUGR組空腸和回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量與對照組差異均不顯著，這說明Arg的母體效應(yīng)確實(shí)能提高IUGR仔豬小腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量到正常仔豬水平。本試驗(yàn)Arg的母體效應(yīng)能提高IUGR仔豬小腸的免疫細(xì)胞數(shù)量的機(jī)制與Arg的多種營養(yǎng)生理特性有關(guān)。Sukhotnik等［21］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充Arg能提高小腸黏膜厚度，提高黏膜DNA含量和蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)大鼠小腸細(xì)胞的增殖和受損黏膜的修復(fù)。Arg的母體效應(yīng)可能提高了IUGR小腸黏膜中胰島素的水平，胰島素與受體結(jié)合后，導(dǎo)致胞內(nèi)胰島素受體底物的多個(gè)酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，激活磷脂酰肌醇3－激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)信號，Akt又促進(jìn)了下游分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的磷酸化，從而調(diào)節(jié)蛋白合成、細(xì)胞遷移和腸道復(fù)原，在細(xì)胞蛋白合成和生長中發(fā)揮重要作用［22－24］。此外，在腸道上皮細(xì)胞中，PI3K 可促進(jìn)腸道黏膜細(xì)胞的增殖，Arg對PI3K信號的激活，可能促進(jìn)了腸上皮免疫細(xì)胞的增殖［25］。這可能使得Arg抑制了腸道表皮中肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，從而提高了IUGR仔豬腸道的免疫功能。

IUGR仔豬的小腸組織生長在出生后1周內(nèi)能部分實(shí)現(xiàn)補(bǔ)償，而且補(bǔ)償生長的實(shí)現(xiàn)是隨著日齡增加逐步完全的［26］。本試驗(yàn)A rg+IUGR組仔豬的初生重極顯著低于對照組和IUGR組，但Arg+IUGR組仔豬7及21日齡體重增至與IUGR組仔豬差異不顯著。這提示Arg對于IUGR的生長補(bǔ)償有促進(jìn)作用。而Arg+IUGR組仔豬腸道各項(xiàng)指標(biāo)均高于對照組或與對照組相當(dāng)，這說明Arg的母體效應(yīng)在仔豬妊娠期間對于IUGR仔豬腸道免疫細(xì)胞的增殖顯示出很好的補(bǔ)償作用，但是A rg的作用沒有明顯提高IUGR仔豬初生重和7和21日齡的體重至正常仔豬水平，這可能是由于Arg的補(bǔ)償生長作用僅恢復(fù)了IUGR仔豬腸道免疫細(xì)胞的數(shù)量和腸道的正常功能，而Arg對腸道免疫功能促進(jìn)作用卻不足以彌補(bǔ)IUGR仔豬初生重低的不足，才使得IUGR仔豬的體重沒有明顯提高。此外，Muaku等［27］研究發(fā)現(xiàn)，外源促生長因子能促進(jìn)IUGR幼鼠在生后23 d完全實(shí)現(xiàn)補(bǔ)償生長。本試驗(yàn)Arg的母體效應(yīng)并未實(shí)現(xiàn)完全補(bǔ)償生長，這可能是由于試驗(yàn)期太短，Arg的補(bǔ)償作用還未完全實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論

在妊娠母豬飼糧中添加1%的Arg可促進(jìn)哺乳期低初生重IUGR仔豬的補(bǔ)償生長，并提高IUGR仔豬的平均日增重至正常仔豬水平。Arg的母體效應(yīng)能顯著地提高7及21日齡IUGR仔豬小腸黏膜上皮肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量，提高IUGR仔豬的免疫功能，改善腸道免疫機(jī)能。

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