痛情緒反應(yīng)量化方法的探索*

張肖怡蘭坤馮曉璞宋瑞瑞張策張宇

痛情緒反應(yīng)量化方法的探索*

張肖怡①蘭坤②馮曉璞①宋瑞瑞③張策①張宇①

目的：在經(jīng)典的formalin誘導(dǎo)的條件位置回避模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件探索一種新的痛情緒測量。方法：完全弗氏佐劑（CFA）誘導(dǎo)的條件性位置回避。方法：雄性SD大鼠左側(cè)足底皮下注射完全弗氏佐劑，建立條件性位置回避（CPA）模型。結(jié)果：SD大鼠足底皮下注射CFA會(huì)引起持續(xù)的炎性疼痛，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的條件性位置回避。足底注射生理鹽水（NS）組和空白對照（naive）組不能產(chǎn)生條件性位置回避。結(jié)論：CFA誘導(dǎo)的CPA模型可以作為痛情緒量化的一種方法。

完全弗氏佐劑； 條件性位置回避； 持續(xù)性炎性痛； 痛情緒； 大鼠

國際疼痛研究學(xué)會(huì)（IASP）曾定義“疼痛是一種與組織損傷或潛在的損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情緒體驗(yàn)”。說明疼痛包含兩種成分：即痛的感覺分辨（sensory discrimination）和痛的情緒反應(yīng)（affective dimensions）。前者主要編碼和感受刺激的屬性，包括刺激的性質(zhì)、強(qiáng)度、位置等；后者指痛的情緒、情感特性，涉及編碼傷害性刺激所引發(fā)的厭惡、焦慮、恐懼等負(fù)性情緒。在過去的幾十年中，對痛感覺成分的研究在整體、細(xì)胞、分子和基因等各個(gè)層次上獲得了大量成果，針對這些成果也設(shè)計(jì)成許多新藥，但大都療效有限，往往還產(chǎn)生較大的副作用。一些報(bào)道表明，慢性疼痛常常伴有患者的情緒障礙，如孤獨(dú)、恐懼、焦慮、甚至厭世等給患者帶來的身心傷害遠(yuǎn)比疼痛本身更為嚴(yán)重，也受到了研究者的廣泛關(guān)注[1-3]。這說明痛情緒反應(yīng)在慢性持續(xù)性疼痛過程中起著非常重要的作用。但對于痛情緒的研究，由于實(shí)驗(yàn)方法和動(dòng)物模型的限制，進(jìn)展十分有限。

2001年，Johansen等[4]采用條件性位置回避裝置最早在嚙齒類動(dòng)物上分離出了行為意義上的痛情緒。此后學(xué)者們也越來越多的采用條件性位置回避裝置（conditioned place avoidance，CPA）來衡量和量化痛情緒。在國內(nèi)，Gao等[5]根據(jù)Johansen等[4]的研究成功復(fù)制了formalin誘導(dǎo)的條件性位置回避模型，多數(shù)采用4～6 d的訓(xùn)練方法。除了formalin被用作疼痛模型的致痛物質(zhì)外，完全弗氏佐劑（Complete Freund’s adjuvant，CFA）也常被用在持續(xù)性炎性疼痛的模型中。筆者實(shí)驗(yàn)室根據(jù)前者formalin誘導(dǎo)的條件位置回避模型研究的經(jīng)驗(yàn)，建立了簡便、有效，實(shí)驗(yàn)周期更短的CFA誘導(dǎo)的條件位置回避模型。

CFA是一種油包水的乳濁液，能夠非常有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體。它含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，可以加強(qiáng)對抗原的抗體反應(yīng)。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應(yīng)，注射入哺乳動(dòng)物皮下之后，會(huì)產(chǎn)生炎癥和疼痛。大鼠足底注射CFA是一個(gè)被廣泛應(yīng)用的慢性炎性痛模型，進(jìn)行炎性痛相關(guān)機(jī)理的基礎(chǔ)研究[6]。在注射CFA后，動(dòng)物局部會(huì)出現(xiàn)較長時(shí)間的紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)以及對熱刺激或機(jī)械刺激反應(yīng)敏感的特征。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]和本實(shí)驗(yàn)之前的研究發(fā)現(xiàn)，CFA導(dǎo)致的熱痛敏的高峰出現(xiàn)在注射后2～6 h，并持續(xù)約1～2周左右，是種良好的持續(xù)性炎性痛模型。因此，筆者考慮把CFA慢性痛模型和條件位置回避結(jié)合起來，建立完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的條件性位置回避模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取21只雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，重量250～270 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物房內(nèi)，室溫控制在（22±1）℃，12～12 hrs晝夜循環(huán)光照。正式實(shí)驗(yàn)開始前3～5 d大鼠先初步適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。將所有大鼠分為空白對照組（naive）6只、足底皮下注射生理鹽水組（NS）7只和足底注射CFA組（CFA）8只，各組大鼠的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑和藥品 完全弗氏佐劑（sigma）和生理鹽水1：1混合試劑

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 筆者結(jié)合以往的研究及本實(shí)驗(yàn)室的條件，改進(jìn)出條件位置回避的裝置[8-10]。如圖1所示，具體裝置為一有機(jī)玻璃材質(zhì)的長盒（長60 cm，寬15 cm，高25 cm），平均分為兩個(gè)室，中間用可抽取的有機(jī)玻璃材質(zhì)的門阻隔。一個(gè)室外三面貼有間隔一致紅色水平條帶，底部為3 mm×3 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼；另一個(gè)室外三面貼有間隔一致的藍(lán)色垂直條帶，底部為6 mm×6 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼；中間的隔板門分別貼有同側(cè)隔室一致的條紋，貼有藍(lán)色垂直條紋的室外掛有一個(gè)小LED燈，亮度為能夠使同側(cè)的隔室有微弱的亮光，這樣建立的兩個(gè)相對獨(dú)立的環(huán)境讓大鼠在視覺和觸覺上會(huì)有明顯差別，但不會(huì)使大鼠出現(xiàn)明顯的環(huán)境偏好。整個(gè)裝置放在比較安靜、光線暗的環(huán)境中，遠(yuǎn)離裝置1 m遠(yuǎn)處有個(gè)15 W的燈，保持環(huán)境光線的穩(wěn)定。在裝置的頂部裝有紅外攝像頭，與外部的電腦相連，這樣可以記錄大鼠在實(shí)驗(yàn)階段的運(yùn)動(dòng)情況。完成后電腦系統(tǒng)自動(dòng)可以分析大鼠在兩側(cè)裝置中停留的時(shí)間。

其中兩室隨機(jī)作為“疼痛環(huán)境”適應(yīng)區(qū)和“非痛環(huán)境”適應(yīng)區(qū)，中間的擋板可抽取。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 由CPA誘導(dǎo)的條件位置回避實(shí)驗(yàn)過程分為3 d。

1.4.1 第1天 Pre-conditioning Day將裝置中間的隔板取出，讓大鼠在裝置中自由活動(dòng)10 min，分別記錄大鼠在兩室中停留的時(shí)間。

圖1 條件位置回避裝置

1.4.2 第2天 Conditioning Day將裝置中間隔板插入，將整個(gè)裝置分隔成兩個(gè)相對獨(dú)立的室，將大鼠任意放入其中一個(gè)室中，為“非痛環(huán)境”適應(yīng)區(qū)，自由活動(dòng)30 min。之后將大鼠取出放回飼養(yǎng)籠，30 min后給大鼠左側(cè)足底皮下注射0.08 mL的CFA，其中CFA和生理鹽水1：1混合均勻。2 h后，將大鼠放入另外一個(gè)室，為“疼痛環(huán)境”適應(yīng)區(qū)。在自由活動(dòng)30 min后，把大鼠取出，放回飼養(yǎng)籠。

1.4.3 第3天 Post-conditioning Day裝置中間隔板取出，大鼠在裝置中自由活動(dòng)10 min，分別記錄大鼠在兩室中停留的時(shí)間。

在實(shí)驗(yàn)過程中，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%的酒精擦洗整個(gè)裝置。如果大鼠第3天在“痛環(huán)境”匹配室所停留的時(shí)間少于第1天在該室停留的時(shí)間，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則說明大鼠產(chǎn)生了條件性位置回避（CPA），也說明CFA誘導(dǎo)的條件性位置回避模型成功建立。用大鼠第3天在“痛環(huán)境”停留的時(shí)間減去第1天在該室停留的時(shí)間，其差值稱為回避分?jǐn)?shù)（CPA Score），其數(shù)值的絕對值大小代表了CPA的程度，回避分?jǐn)?shù)越大，表示回避程度越大，證明痛情緒越明顯。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，計(jì)量資料用（±s）表示，大鼠在“痛環(huán)境”匹配室的前后停留時(shí)間時(shí)間進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，組間比較進(jìn)行非配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白對照組和足底注射NS組大鼠第3天在“疼痛環(huán)境”匹配室的時(shí)間與第1天比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；足底注射CFA后，大鼠第3天在“疼痛環(huán)境”匹配室的時(shí)間明顯少于第1天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對“疼痛環(huán)境”產(chǎn)生了厭惡反應(yīng)，見表1、圖2。空白對照組和足底注射NS組的回避分?jǐn)?shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而足底注射CFA組的回避分?jǐn)?shù)明顯大于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

表1 各組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室前后停留時(shí)間的比較（±s）s

表1 各組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室前后停留時(shí)間的比較（±s）s

*與Pre-conditioning比較，P＜0.05

組別 Pre-conditioning Post-conditioning空白對照組（n=6） 286.1±38.62 297.6±75.02足底皮下注射生理鹽水組（n=7） 301.6±76.4 291.34±109.8足底注射CFA組（n=8） 304.1±39.8 156.5±80.2*

圖2 各組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室前后停留時(shí)間比較

圖3 各組大鼠回避分?jǐn)?shù)比較

3 討論

隨著現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們越來越重視生存質(zhì)量的提升。然而，各種疾病往往都伴隨著疼痛的產(chǎn)生，目前疼痛已經(jīng)成為繼呼吸、脈搏、血壓、體溫4大生命體征之后的第5大生命體征。眾所周知，疼痛包括對痛刺激的主觀感覺和情緒體驗(yàn)。臨床上的觀察顯示，疼痛的負(fù)性情緒給患者帶來的痛苦遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于痛刺激本身，因此，疼痛所帶來的負(fù)性情緒的發(fā)生機(jī)制和緩解方法受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[1-3]。例如，Rainville等[11]采用催眠暗示法發(fā)現(xiàn)，在痛刺激強(qiáng)度不變的情況下，隨著受試者被暗示刺激強(qiáng)度升高，其不愉快程度也升高，與此同時(shí)前扣帶皮層（anterior cingulated cortex，

ACC）的興奮程度隨之增強(qiáng)。2001年，Johansen等[4]指出吻側(cè)ACC是與痛情緒高度相關(guān)的大腦皮層。也有研究表明，ACC內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體依賴的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（extracellular signal regulated kinase-cAMP response element binding protein，ERK-CREB）信號(hào)通路參與了大鼠痛厭惡情緒的形成[5，12-14]。筆者實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，電針可以緩解疼痛中的情緒部分。

疼痛會(huì)引起情緒情感的反應(yīng)過去早有發(fā)現(xiàn)，但苦于一直沒有很好的動(dòng)物模型進(jìn)行更深入的研究。Johansen等[4]采用formalin誘導(dǎo)產(chǎn)生的條件化位置回避裝置最早在嚙齒類動(dòng)物上分離出了行為意義上的痛情緒，為此類研究提供了新的方法和思路。該方法利用大鼠足底皮下注射formalin，誘導(dǎo)出F-CPA行為反應(yīng)，說明formalin的刺激使大鼠記住了發(fā)生疼痛時(shí)的環(huán)境并因此而對“痛環(huán)境”產(chǎn)生了厭惡情緒?，F(xiàn)有許多學(xué)者沿用或改進(jìn)了這樣的方法來研究痛情緒反應(yīng)。張玉秋教授的實(shí)驗(yàn)室等根據(jù)Johansen等[4]的研究，結(jié)合實(shí)際情況復(fù)制出了福爾馬林誘導(dǎo)的條件性位置回避模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也比較穩(wěn)定。福爾馬林是甲醛的水溶液，誘導(dǎo)一個(gè)雙時(shí)相的疼痛反應(yīng)，第一時(shí)相（早時(shí)相）反應(yīng)在注射后立即出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)分鐘，第二時(shí)相（晚時(shí)相）經(jīng)過一個(gè)潛伏期，可持續(xù)數(shù)10 min左右[15]。同時(shí)根據(jù)相同的原理，也設(shè)計(jì)出了由激光誘導(dǎo)的條件性位置回避、由電擊誘導(dǎo)的條件性位置回避模型和由高滲鹽水誘導(dǎo)的條件性位置回避模型，都取得了不錯(cuò)的效果[16-17]。

筆者采用完全弗氏佐劑（CFA）來誘導(dǎo)產(chǎn)生類似的逃避行為，主要是因?yàn)镃FA作為在疼痛研究中常被使用的炎性致痛物質(zhì)，能在注射部位局部產(chǎn)生明顯、持續(xù)時(shí)間較長的炎性反應(yīng)，后者能引起大鼠痛敏，其高峰出現(xiàn)在注射后2～6 h，并持續(xù)約2周左右，將痛敏高峰與環(huán)境加以耦合，這樣可以很好地模擬出炎性疼痛對環(huán)境產(chǎn)生的厭惡表現(xiàn)，即對痛環(huán)境的逃避[6-7]。根據(jù)上述的研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)足底注射完全弗氏佐劑可以很好地產(chǎn)生條件性位置回避，而且與formalin或其他模型比較，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，也便于實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行操作。這為利用動(dòng)物模型對痛情緒展開更深入的研究提供了又一種簡便、易行的新選擇。

[1] Gureje O.Psychiatric aspects of pain[J].Curr Opin Psychiatry，2007，20（1）：42-46.

[2] Asmundson G J，Katz J.Understanding the co-occurrence of anxiety disorders and chronic pain：state-of-the-art[J].Depress Anxiety， 2009，26（10）：888-901.

[3] Crombez G，Vlaeyen J W，Heuts P H，et al.Pain-related fear is more disabling than pain itself：evidence on the role of pain-related fear in chronic back pain disability [J].Pain，1999，80（1-2）：329-339.

[4] Johansen J P，F(xiàn)ields H L，Manning B H.The affective component of pain in rodents：direct evidence for a contribution of the anterior cingulate cortex[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（14）：8077-8082.

[5] Gao Y J，Ren W H，Zhang Y Q，et al.Contributions of the anterior cingulate cortex and amygdala to pain-and fear-conditioned place avoidance in rats[J].Pain，2004，110（1-2）：343-353.

[6] Ren K，Dubner R.Inflammatory models of pain and hyperalgesia[J]. ILAR J，1999，40（3）：111-118.

[7] Iadarola M J，Brady L S，Draisci G，et al.Enhancement of dynorphin gene expression in spinal cord following experimental inflammation：stimulus specificity，behavioral parameters and opioid receptor binding[J].Pain，1988，35（3）：313-326.

[8] Fenu S，Spina L，Rivas E，et al.Morphine-conditioned single-trial place preference： role of nucleus accumbens shell dopamine receptors in acquisition，but not expression[J].Psychopharmacology（Berl），2006，187（2）：143-153.

[9] Zhang Y，Meng X，Li A，et al.Acupuncture alleviates the affective dimension of pain in a rat model of inflammatory hyperalgesia[J]. Neurochem Res，2011，36（11）：2104-2110.

[10] Zhang Y，Meng X，Li A，et al.Electroacupuncture alleviates affective pain in an inflammatory pain rat model[J].Eur J Pain，2012，16（2）：170-181.

[11] Rainville P，Duncan G H，Price D D，et al.Pain affect encoded in human anterior cingulate but not somatosensory cortex[J].Science，1997，277（5328）：968-971.

[12] Li T T，Ren W H，Xiao X，et al.NMDA NR2A and NR2B receptors in the rostral anterior cingulate cortex contribute to pain-related aversion in male rats[J].Pain，2009，146（1-2）：183-193.

[13]曹紅，張玉秋.ERK/MAPK信號(hào)通路與痛覺信息加工[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（6）：370-373.

[14] Cao H，Gao Y J，Ren W H，et al.Activation of extracellular signalregulated kinase in the anterior cingulate cortex contributes to the induction and expression of affective pain[J].J Neurosci，2009，29 （10）：3307-3321.

[15] Abbott F V，F(xiàn)ranklin K B，Westbrook R F.The formalin test：scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats[J].Pain，1995，60（1）：91-102.

[16] Kung J C，Su N M，F(xiàn)an R J，et al.Contribution of the anterior cingulate cortex to laser-pain conditioning in rats[J].Brain Res，2003，970（1-2）：58-72.

[17]王儉勤，曹紅，張玉秋.痛情緒形成過程中的影響因素[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2013，18（11）：670-674.

Exploration of Pain Emotional Response Quantization Method

/ZHANG Xiao-yi，LAN Kun，F(xiàn)ENG Xiaopu，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：045-048

Objective：To explore a new method for measuring pain mood：Complete Freund’s adjuvant（CFA）-induced CPA model to measure affective dimension of pain，based on the classical formalin of conditioned place avoidance （F-CPA） model and our laboratory conditions.Method：The male Sprague-Dawley （SD） rats’ left hind paw were given hypodermic injection the CFA，successfully established CFA induced CPA model in rat.Result：Compared with the injection of normal saline（NS） group and blank control group，intra-plantar injection of CFA induced persistence inflammatory pain and stabile CPA.Conclusion：CFA-induced CPA model in rat can be a method of reflecting painrelated negative emotion.

Complete Freund’s adjuvant； Conditioned place avoidance； Persistence inflammatory pain；Affective dimension of pain； Rat

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.015

2014-04-11） （本文編輯：歐麗）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371254）

①山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系 山西 太原 030001

②山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像系

③山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

張策 張宇

First-author’s address：Department of Physiology in Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China