遼東楤木根皮和人參莖葉總皂苷提取物對過度訓練大鼠海馬鹽皮質類固醇受體MR，糖皮質激素受體GR蛋白表達的影響*

常 波，高珊珊，郭 琪，宋 洋，周丹丹，房 亮，李 騰

(1.沈陽體育學院運動人體科學學院，遼寧沈陽 110102;2.沈陽體育學院研究生部，遼寧 沈陽 110102)

隨著競技體育水平的不斷提高，在追求最大應激反應的過程中有時會越過人體的生理極限，造成機體在一定時間內無法恢復的過度疲勞，它是一種病理性的改變，而非生理性的改變。不僅影響到正常的比賽和訓練，還威脅到運動員的健康。而運動訓練中如何科學訓練，防止過度訓練的發(fā)生，對于過度訓練癥候如何進行調理也是目前運動醫(yī)學研究的熱點問題。

本文探討遼東楤木根皮醇提取物和人參莖葉總皂苷對過度訓練大鼠海馬鹽皮質類固醇受體MR，糖皮質激素受體GR蛋白表達的影響，探討過度疲勞發(fā)生的機制，尋找過度訓練的防治的手段，為競技體育服務。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

雄性Wistar大鼠77只，體重200g左右，按體重分層，隨機分5組，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食水。大鼠每天上午均灌胃給藥，藥物由沈陽藥科大學提供。各運動組大鼠每周運動6次，方式為遞增負荷游泳，持續(xù)六周。具體試驗分組及游泳給藥情況見表1。

表1 大鼠分組及給藥方案

表2 大鼠運動方案

大鼠在玻璃泳缸中游泳，大鼠運動方案見表2。在大鼠游泳過程中出現(xiàn)力竭時(力竭標準為大鼠從水面下沉，經(jīng)10s后仍不能返回水面)，將其撈出，休息一定時間(5min～30min)后，放入泳缸中繼續(xù)完成游泳負荷。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅蛋白的測定:采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定，按說明書進行測定。

1.2.2 尿素氮的測定:采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，用肝素抗凝的血清測定。按試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 尿總蛋白的測定::解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所試劑盒測定。

1.2.4 睪酮的測定:大鼠斷頭處死，取血后分離血清，置于－20℃冰箱保存。用放射免疫分析法測定血睪酮。采用深圳拉爾文生物工程有限公司提供的試劑盒(進口分裝)，嚴格按說明書進行操作。

1.2.5 皮質酮的測定:大鼠斷頭處死，收集全血，肝素抗凝。皮質酮的提取用乙醇。采用Diagostic Products公司提供的試劑盒，嚴格按說明書進行操作。

1.2.6 Western Blot基本步驟

(1)樣品(蛋白)的提取

①胞漿蛋白的提取:組織以1:5比例加入裂解緩沖液，200mg加1mlbuffer(20mmol/l TRIShcl Ph:7.5(0.1mmol/l Na3Vo4 25mmol/l NaF 2mmol/l EDTA EGTA 1mmol/l DTT，1mg/ml亮肽素/抑肽酶/，勻漿機勻漿，4度12000rpm離心1h，上清為漿蛋白組分。

②膜蛋白的提取:取上述沉淀加入膜蛋白提取液(含1%Triton)超聲波粉碎(冰水中)4度過夜，4度12000rpm離心1h上清為膜蛋白。

③核蛋白的提取:利用差速離心法提取細胞核，加入核裂解液4度超聲破碎，離心，4度12000rpm，1h，上清為核蛋白組分。

(2)電泳:根據(jù)分子量不同選擇不同濃度的膠。

2 統(tǒng)計學處理

所獲數(shù)據(jù)用SPSS10.0數(shù)據(jù)軟件包進行處理，采用平均數(shù)±標準差(ˉx±SD)表示，組間采用單因素方差分析判斷總體顯著性差異，顯著性水平定在P＜0.05和P＜0.01。

3 實驗結果

3.1 遼東楤木根皮醇提取物和人參莖葉總皂苷對6周遞增負荷游泳訓練后各組大鼠的一般觀察及血、尿生化指標的變化

3.1.1 一般觀察

從第四周開始，運動對照組大鼠運動能力下降，需要休息的時間也長，游后精疲力竭、喘息不止、掉毛現(xiàn)象嚴重，有的甚至是整塊掉毛、毛色晦暗、體型瘦弱、神態(tài)疲憊、易受驚嚇。而服藥組大鼠掉毛現(xiàn)象不明顯，毛色光亮，無明顯的疲憊神態(tài)，游泳后很快能弄干身上的毛。

3.1.2 6周遞增負荷游泳訓練后各組大鼠血清睪酮(T)濃度、皮質酮(C)濃度、血清睪酮/皮質酮比值(T/C)、血紅蛋白(Hb)、血清尿素氮(BUN)和尿蛋白(TP)含量的結果。

本實驗對6周遞增負荷游泳訓練大鼠的一般情況、運動能力及血、尿生化指標的變化進行觀察與測定，發(fā)現(xiàn)運動對照組大鼠一般情況差、運動能力降低、血清睪酮濃度和血紅蛋白含量下降、血清皮質酮濃度、血清尿素氮和尿蛋白含量增高。結合有關過度訓練判定標準的相關文獻，綜合分析認為運動對照組大鼠經(jīng)6周遞增負荷游泳訓練后，大鼠已達到過度訓練狀態(tài)。

表3 6周遞增負荷游泳訓練后各組大鼠的血、尿生化指標

3.2 遼東楤木根皮醇提取物和人參莖葉總皂苷對過度訓練大鼠海馬MR，GR蛋白表達的影響

見表4，各組MR無顯著差異。

與NC組相比較，EC組GR蛋白表達極顯著下降，P＜0.01。

與EC組相比較，PG、LA和HA組GR蛋白表達顯著升高(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05)。

與PG組相比較，LA和HA組GR蛋白表達明顯下降(P＜0.05)。

表4 不同組別大鼠海馬MR，GR蛋白的表達

圖1 海馬GR、MR的蛋白表達圖譜

4 討論

4.1 過度訓練及過度疲勞訓練模型的建立:

Lehman等也提出了過度訓練的另一種詮釋:即訓練和恢復、運動與運動能力、應激與應激耐受力之間的失衡狀態(tài)。過度訓練所表現(xiàn)的各種癥狀稱為過度訓練癥候群(overtraining syndrome，OTS)。其呈現(xiàn)高度的個體化特點，不同運動員之間的差別很大。根據(jù)不同運動員過度訓練的表現(xiàn)可分為交感型過度訓練癥候群和副交感型過度訓練癥候群。

OTS常常是由于心理和生理混合因素造成的。它是多種現(xiàn)實生活應激刺激累積的結果，這些應激刺激包括:運動訓練、睡眠不足、環(huán)境應激(熱、冷、高海拔等)、職業(yè)壓力及人際沖突等。焦慮的急劇增加與體力的疲勞一樣，都可使一個人對應激耐受力下降。對比賽感情上的需求、勝利的渴望、失敗的懼怕、不現(xiàn)實的高目標等都可能是無法忍受的心理應激之源。因此，典型的OTS一般都伴隨著比賽欲望和訓練熱情的降低。

過度訓練是繼發(fā)于運動訓練的應激反應，其生理機制尚不完全清楚。許多研究提示，過度訓練與植物性神經(jīng)紊亂、內分泌功能改變和免疫功能下降密切相關。

朱全與浦鈞宗等用超負荷訓練大鼠游泳的方法，建立了鼠模擬過度訓練模型。大鼠隨機分為3組:①對照組;②一般游泳訓練組(NT)，進行中等強度游泳訓練;③過度負荷組(OT)，即過度訓練組，采用負重的方法增加游泳訓練的強度，并在訓練的后期，使訓練動物反復運動至力竭。結果表明:過度負荷組大鼠在訓練的后期，普遍出現(xiàn)了運動能力下降，血清睪酮濃度明顯下降、皮質酮濃度明顯升高，睪酮/皮質醇比值較對照組下降94.2%。

在本實驗中發(fā)現(xiàn)，運動組大鼠經(jīng)過6周遞增負荷游泳后，普遍出現(xiàn)毛色等一般狀況惡化和運動能力下降。末次運動24小時后血尿生化檢查表明:運動組大鼠T、T/C比值和Hb較正常組分別下降73.94%，86.97%和20.14%，C較正常組升高97.73%，分別超過30%、30%、20%和20%的人類過度訓練診斷參考標準。同時，運動組大鼠BUN和TP較正常組分別升高107.19%和202.69%。根據(jù)上述一般情況觀察和血尿生化檢查結果綜合評定，結合朱全，鄭陸等提出大鼠過度訓練判斷標準。以及馮煒權教授根據(jù)運動員在過度訓練后血液和尿液中生化指標的變化提出了診斷過度訓練的參考值［4］，這些指標反映了機體的代謝狀況和運動能力，如血睪酮、血睪酮/皮質酮及血尿素氮反映了機體的代謝情況進行判定，大鼠經(jīng)過6周遞增負荷訓練已經(jīng)達到過度訓練狀態(tài)。

4.2 遼東楤木根皮醇提取物和人參莖葉總皂苷對過度訓練大鼠海馬MR，GR蛋白表達的影響

機體在接受或感知到環(huán)境或軀體變化(應激)時可以引起機體發(fā)生相應的行為和生理變化，包括自主神經(jīng)活動改變如交感神經(jīng)活動增強和神經(jīng)內分泌活動改變，如下丘腦多個內分泌軸的激活，主要表現(xiàn)為交感－腎上腺髓質及HPA軸的功能增強。這是應激反應的最重要特征。HPA軸激活是機體對應激的最重要的適應性反應，GC的分泌有利于機體動員能量和保持內環(huán)境的穩(wěn)定。然而，慢性應激有很多病理效應。大鼠研究結果表明，慢性應激可引起海馬損害，其主要機制是長期高GC血癥的神經(jīng)毒性作用。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分是HPA軸應激反應的高位調節(jié)中樞。正常情況下，海馬可以抑制HPA軸的活性;在腦中，海馬上GC受體表達最高，而對應激反應非常敏感且易損。在應激性海馬損傷與血中，GC持續(xù)升高之間有著密切的互為因果的關系。

海馬對HPA軸調節(jié)是通過其高密度皮質醇類激素受體MR及GR完成的，MR參與基礎水平HPA軸的副反饋調節(jié)，它介導HPA軸基礎活性的維持且與中樞應激反應閾值及敏感性有關。而GR還參與應激誘導的高水平GC的副反饋調節(jié)。應激狀態(tài)MR/GR平衡失調使神經(jīng)元處于易損狀態(tài)，易于發(fā)生應激損傷疾患。

有研究表明，海馬萎縮與衰老性神經(jīng)元缺失有關，一些學者認為GC與興奮性氨基酸(EAA)協(xié)同作用有關，并通過NMDA受體產(chǎn)生作用，GC與EAA協(xié)同損傷海馬神經(jīng)元。也有學者提出慢性應激運動時，EAA可能通過體內的Glu－NMDA受體－Ca2+－NO途徑，引起海馬組織的損害。另外，應激可以引起海馬谷氨酸釋放升高。慢性應激導致海馬神經(jīng)生長因子(NGF)mRNA表達降低。此外，GC引起海馬神經(jīng)元能量代謝紊亂及Ca2+失衡也可能是海馬神經(jīng)元損傷的原因之一。

我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，各組海馬鹽皮質激素受體受體(MR)蛋白表達沒有發(fā)生顯著性變化，而過度訓練組海馬GR蛋白表達顯著下降，提示過度訓練導致高皮質酮血癥出現(xiàn)可能與GR蛋白表達下降，引起的海馬損傷及功能失調，HPA軸負反饋障礙有關。

遼東楤木［Aralia elata(Miq.)Seem］，是最接近人參屬的一種植物，又稱刺龍牙、龍牙楤木，主要分布于我國東北地區(qū)，資源豐富。其根味辛，性平，歸肝、胃、腎經(jīng)，有小毒［7］。其藥用部位為該植物根皮、樹皮及葉。其化學成分有皂甙類化合物，主要是三萜皂甙類，其甙元多為齊墩果酸及其衍生物，如Araloside A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I;脂肪類化合物:分別是十五酸甲酯、十六酸甲酯、二十酸甲酯、二十六酸甲酯、二十六碳烯－1、二十六碳醇和二十四酸甲酯、二十四碳飽和脂肪酸、β－谷甾醇 、楤木皂苷A甲酯 、胡蘿卜苷－6－棕櫚酸酯;揮發(fā)油類化合物:證實有37種物質，主要是α－姜黃烯;黃酮類化合物及15種氨基酸和18種以上無機元素等，此外還含有生物堿、鞭質、膽堿等多種成分。

我們的研究結果也發(fā)現(xiàn)人參和遼東楤木提取物均可提高海馬GR蛋白的表達，對于改善海馬對HPA軸負反饋的調節(jié)，對降低過度訓練導致的應激反應(高皮質醇血癥)，避免免疫抑制的發(fā)生具有積極作用，且人參提取物優(yōu)于高、低劑量的遼東楤木提取物。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，饑俄及低血糖引起血中皮質酮水平升高，誘導大鼠胸腺細胞凋亡，并證明GR介導了這一作用，也有學者研究認為，GC引起胸腺細胞凋亡依賴于NF－кB/c－myc通路，從而引起免疫功能下降。

應激激素對海馬的損傷可能是通過凋亡的方式完成的，應激誘發(fā)有復雜的起始及中間過程，最終導致其相關基因及基因表達的異常，蛋白質(如GC受體、BDGF等)表達的質或量的異常，反過來又會使其起始及中間過程的紊亂加重，這種惡性循環(huán)的形成也許是運動性疲勞，包括運動性高皮質醇、低血睪酮血癥及運動性閉經(jīng)和運動性免疫抑制等慢性運動應激造成的原因之一。

近年來有些學者提出了慢性應激時，可能存在致大腦損害的HPA－Glu－NMDA受體－NO路徑。

在慢性應激過程中，持續(xù)的HPA軸激活和糖皮質激素(GC)高分泌對海馬結構的損害表現(xiàn)為干擾細胞的代謝，降低細胞的生存能力。研究表明，慢性應激時，海馬內的Glu的堆積，造成海馬的毒性;另一方面，細胞外高水平的Glu又使HPA軸功能亢進，使GC水平更高。過多的Glu釋放及其受體激活，引起神經(jīng)元持續(xù)去極化，導致離子滲透壓力和電化學改變，繼而是鈣離子通過電壓依賴性鈣通道或NMDA受體聯(lián)結的通道緩慢內流，造成細胞內鈣離子超載，結果引起細胞壞死。另外，Glu的損害作用還表現(xiàn)在抑制海馬神經(jīng)元保護因子的合成和釋放。

神經(jīng)元、膠質細胞和腦血管壁均可產(chǎn)生NO，低濃度的NO起信使作用，而高濃度的NO則具有細胞毒性，海馬中同時有多種一氧化氮合酶(NOS)分布，而腦內NO濃度過高時，則又會通過其毒性自由基造成細胞組織損傷。

其假說可能為:緊張、應激 新皮層 —→邊緣系統(tǒng)興奮—→HPA軸激活

過量分泌應激激素(包括可的松)—→刺激海馬GC敏感性神經(jīng)元—→HPA軸負反饋障礙—→慢性持續(xù)性過量分泌應激激素—→過度刺激GC敏感神經(jīng)元，使之退化變性—→進行性認知行為失調等。

總之，在慢性應激(過度訓練)，從反應行為、解剖結構和神經(jīng)生化方面可能會引起下丘腦－垂體－腎上腺(HPA)軸的功能亢進，谷氨酸(Glu)的堆積，一氧化氮(NO)的合成異常，神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)的下調即可能通過HPA－Glu－NMDA受體－NO途徑，損害海馬結構等腦組織，導致運動性高皮質醇血癥等運動性疾病的發(fā)生，這可能是導致過度訓練的原因之一。

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