嗜冷酶的特性及其在食品工業(yè)上的應(yīng)用

王繼蓮，魏云林，李明源，*

(1.喀什師范學(xué)院生物與地理科學(xué)系葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什844000; 2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500)

在地球這個大的生態(tài)系統(tǒng)中，超過80%的地方溫度低于5℃，如占地球表面14%的南北兩極地區(qū)、高山、深海及冰川凍土等，在這些特殊環(huán)境中生活著一類特殊的微生物－嗜冷菌［1］。人們也從許多人工高寒環(huán)境(如冷庫、冰箱)中分離到嗜冷菌。由于長期生活在極冷的環(huán)境條件下，嗜冷菌在其細(xì)胞內(nèi)形成了多種具有特殊功能的酶，即嗜冷酶，保證其在低溫條件下的生命活力［2］。嗜冷酶不僅具有普通化學(xué)催化劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如在低溫條件下催化效率高、底物專一性強(qiáng)，且在中高溫條件下能快速失活，終止酶作用，這對于食品行業(yè)上保持食品的品質(zhì)尤為有利。目前，對嗜冷酶的研究尚處于初期階段，但對嗜冷酶的結(jié)構(gòu)特征、嗜冷機(jī)制及應(yīng)用前景已有一些文獻(xiàn)報道。本文主要對嗜冷酶的特性及其在食品工業(yè)上的應(yīng)用前景做一綜述。

1 嗜冷酶的制備

1.1 利用嗜冷菌和基因工程技術(shù)篩選

極端酶的獲得需要對極端微生物進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和酶的發(fā)酵生產(chǎn)。目前嗜冷酶獲取的常規(guī)手段是從天然的嗜冷環(huán)境中采集樣品，富集、分離嗜冷菌，再通過特定選擇標(biāo)記篩選嗜冷酶。實(shí)驗(yàn)室中通常在低溫條件下培養(yǎng)嗜冷菌8～12h，得到較高濃度的細(xì)胞和胞外酶，低溫下更多的酶生成相應(yīng)地加快了酶促反應(yīng)速率。高溫(＞25℃)雖然縮短了嗜冷菌的生長時間，但細(xì)胞濃度低，胞外酶產(chǎn)量少。研究表明大多數(shù)嗜冷菌產(chǎn)生的嗜冷酶在低溫條件下依然能保持很高的催化活性，尤其是胞外酶［3］。因此，嗜冷菌依然是目前獲得嗜冷酶最直接，也是最可靠的來源。

但是人們對環(huán)境的認(rèn)識有限，大部分的嗜冷菌還未被培養(yǎng)，且多數(shù)嗜冷菌生長速度較慢，發(fā)酵條件嚴(yán)格，單純通過培養(yǎng)野生菌來獲得大量嗜冷酶極其困難。一般工業(yè)生產(chǎn)上直接從嗜冷環(huán)境中收集DNA片段，將其隨機(jī)切割成限制性片段，然后將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中表達(dá)。這樣能夠在溫和的培養(yǎng)條件下獲得大量的嗜冷酶，大大縮短時間，提高篩選效率。利用基因重組技術(shù)，克隆極端酶的基因，結(jié)合序列分析探討酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，是目前極端酶酶學(xué)研究的方法之一［4－9］。Feller［10］將兼性嗜冷菌Maraxella TA144的脂肪酶基因?qū)隕.coli中表達(dá)，獲得較高的重組脂肪酶活力，且重組酶與野生酶特性相似。因此，把嗜冷酶基因克隆到嗜溫菌中表達(dá)，不僅產(chǎn)量高，還能夠較好地保持原有的穩(wěn)定性。

隨著DNA測序技術(shù)的提高，許多嗜冷菌的基因組已經(jīng)被解析［11－13］。通過與嗜溫菌的已知基因序列比對，可推測得到許多重要的酶蛋白基因序列，對這些基因表達(dá)蛋白的研究，將進(jìn)一步豐富已有的嗜冷酶資源。

1.2 應(yīng)用定向突變手段篩選

定向進(jìn)化始于某一基因的克隆，后經(jīng)體外誘變和重組產(chǎn)生大量的突變體，在中溫宿主中表達(dá)后，再篩選得到在低溫條件下有催化活力的突變體。天然酶的使用局限性促進(jìn)了蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的快速發(fā)展，通過定向誘變和定向突變提高常溫酶的穩(wěn)定性，并對低溫酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇透脑?，從而獲得新的低溫酶是近年來低溫酶生物技術(shù)的研究方向。定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展不僅為我們獲得新型酶提供了新思路，豐富了酶類資源，也促進(jìn)了許多酶類在工業(yè)催化中的應(yīng)用，利用這種方法已得到多種嗜冷酶［14－16］。

此外，利用DNA改組(DNA shuffling)或雜合酶(hybrid enzyme)技術(shù)，將相關(guān)基因片段任意重組，合成新的基因庫，也有望獲得一些新型嗜冷酶，這些技術(shù)促進(jìn)了現(xiàn)在酶工程的快速發(fā)展。

2 嗜冷酶的結(jié)構(gòu)特征及耐受機(jī)制

嗜冷酶的主要特性，就是在低溫下的高周轉(zhuǎn)率(Kcat)和高催化效率(Kcat/Km)［17－18］，這主要受其特殊的結(jié)構(gòu)特征的影響。人們通常采用以下方法研究酶在低溫條件下的結(jié)構(gòu)完整性和催化功能:a.通過自然或誘導(dǎo)突變，將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結(jié)構(gòu)比對分析;b.對比同屬嗜溫、嗜熱及嗜冷蛋白的結(jié)構(gòu)，或不同生物中具有不同熱穩(wěn)定性的相同蛋白的結(jié)構(gòu)［19］?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，嗜冷酶通過特定區(qū)域或整個蛋白結(jié)構(gòu)柔順性的提高，降低了自身的活化能，使酶具有較高的底物結(jié)合能力，從而降低Km才能在低溫下表現(xiàn)出高催化效率，但高柔韌性結(jié)構(gòu)同樣也引起酶的耐熱性降低。低溫酶松散和開放的結(jié)構(gòu)特性，有助于提高酶分子在催化過程中的構(gòu)象變化能力，一方面為底物到達(dá)酶的活性位點(diǎn)提供更佳的通道和容納位置，提高酶活性位點(diǎn)與底物之間的結(jié)合互補(bǔ)性，并有利于產(chǎn)物的釋放;另一方面可降低活化能以補(bǔ)償反應(yīng)分子的低動能，減少容納龐大底物所耗費(fèi)的能量，在低能耗情況下保證酶的高催化效率。

酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，因此從理論上講，嗜冷酶一級結(jié)構(gòu)的改變對構(gòu)象的變化及其耐冷機(jī)制起主要作用，其微小的變化就會對溫度非常敏感，足以引起酶的活性、柔韌性和耐熱性的變化，使得底物更容易進(jìn)入酶活性中心與其結(jié)合。嗜冷、嗜溫和嗜熱3種DNA連接酶的三維模型分析顯示，其表面親水殘基含量依次升高(69%、75%、77%)，疏水殘基含量依次降低(22%、18%、17%)，中性氨基酸含量也依次降低(21%、18%、14%)，同時，低溫連接酶活性位點(diǎn)的表面可接觸中性殘基含量(20%)也高于其他兩種連接酶(18%、9%)，表明嗜冷酶氨基酸殘基組成對酶的活性、柔韌性和耐熱性具有綜合影響［20］。豬α－淀粉酶中的21個脯氨酸殘基，在嗜冷酶中有12個發(fā)生丟失或被丙氨酸等小分子氨基酸取代［21］;Georlette研究嗜冷、嗜溫和嗜熱菌的谷氨酰脂脫氫酶(glutamate dehydrogenase)、β－內(nèi)酰胺酶(β－lactamases)和α－淀粉酶(α－amylase)等的氨基酸，發(fā)現(xiàn)其中含較少的脯氨酸、精氨酸殘基，脯氨酸與賴氨酸比值也較低;嗜冷磷酸甘油醛異構(gòu)酶中脯氨酸數(shù)量也出現(xiàn)減少［22］。脯氨酸殘基可以減小蛋白非折疊多肽構(gòu)象的自由程度，它們的減少有助于提高蛋白結(jié)構(gòu)的柔順性;精氨酸含量的減少有利于增強(qiáng)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，一般表現(xiàn)為精氨酸摩爾比或精氨酸/(精氨酸+賴氨酸)比值的減?。?3］。

嗜冷酶的嗜冷機(jī)制除與氨基酸的組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)，還受一些弱鍵(如靜電弱相互作用、離子配位鍵、氫鍵、疏水作用)的影響。靜電弱相互作用可提供蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所需的凈自由能，離子對(主要為鹽橋)是蛋白構(gòu)象最穩(wěn)定的因素。人們研究發(fā)現(xiàn)，嗜冷酶中缺乏連接二級結(jié)構(gòu)和蛋白域的表面鹽橋:與豬胰腺淀粉酶相比，低溫α－淀粉酶減少了12個表面鹽橋［24］;從嗜熱、嗜溫到嗜冷丙氨酸脫氫酶，鹽橋數(shù)量依次遞減［25］。氫鍵也是穩(wěn)定蛋白折疊構(gòu)象的一個重要因素，氫鍵的缺乏減小了非折疊多肽構(gòu)象的自由程度，提高了蛋白結(jié)構(gòu)的柔順性［26］。芳香族側(cè)鏈之間由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的芳香環(huán)形成的弱極性相互作用，也是穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的一個重要因素。Feller［10］研究發(fā)現(xiàn)嗜熱枯草桿菌蛋白酶、β－內(nèi)酰胺酶中高度保守的芳香族殘基間的一些芳香族相互作用，在嗜冷酶中消失了;低溫α－淀粉酶中，氨基、氧基及硫基－芳香族相互作用的數(shù)量也出現(xiàn)減少。蛋白核心內(nèi)部由疏水側(cè)鏈聚集成簇所形成的疏水核，是穩(wěn)定蛋白折疊構(gòu)象的重要力量，其疏水作用可提供蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定所需的凈自由能。與嗜溫酶相比，嗜冷酶的疏水核心簇內(nèi)發(fā)生了取代，疏水作用急劇下降:豬α－淀粉酶中形成疏水簇的84個殘基，在嗜冷酶對應(yīng)位置上有25個被取代，結(jié)果嗜冷酶的疏水能力指數(shù)急劇下降，而柔順性參數(shù)則上升了72%［10］;低溫β－內(nèi)酰胺酶、枯草桿菌蛋白酶的整體疏水能力也出現(xiàn)了下降［10］。

此外，溶劑相互作用及表面親水性［27］、具有獨(dú)特性質(zhì)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的插入/刪除、蛋白質(zhì)的折疊、離子束縛作用(如Ca2+)［28］等也對酶的耐熱性有影響。

雖然人們對嗜冷酶進(jìn)行了一些研究，并且也取得了一些成果，但還不足以徹底闡明酶的結(jié)構(gòu)與耐冷機(jī)制之間的關(guān)系。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，酶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、可變性與活性之間的關(guān)系是相當(dāng)復(fù)雜的，到目前為止，還沒有在嗜冷酶中發(fā)現(xiàn)一種或幾種與耐冷性有關(guān)的模式結(jié)構(gòu)，這說明不同酶以不同的結(jié)構(gòu)類型、同種酶以多種結(jié)構(gòu)變化的總和來維持其在低溫條件下的高催化活性。

3 嗜冷酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用

目前已有多種嗜冷酶得到了純化或克隆表達(dá)，主要有脂肪酶、彈性蛋白酶、丙氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等。這些低溫酶的特殊性質(zhì)使其在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有一些優(yōu)勢:低溫下催化反應(yīng)可防止污染(同源的嗜溫酶不活潑);經(jīng)過溫和的熱處理即可使嗜冷酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)［29］。這也是低溫酶能夠廣泛應(yīng)用于生物工程的兩大要素，尤其在食品工業(yè)上，不僅對食物的口感和質(zhì)量有很好的保持作用，且不用擔(dān)心酶持續(xù)作用改變食物的結(jié)構(gòu)，因此具有較好的應(yīng)用前景。

3.1 乳制品行業(yè)

采用高活性嗜冷β－半乳糖苷酶替代傳統(tǒng)的K.luyveromyces產(chǎn)生的β－半乳糖酶，不但可保持高水平的乳糖水解活性，有效降解奶制品中乳糖含量，消除乳糖不耐癥，還可縮短水解時間，減少細(xì)菌污染的風(fēng)險，提高奶制品的品質(zhì)。此外還有脂酶、凝乳酶、過氧化氫酶等。脂酶可用于乳制品和黃油的增香，類可可脂的生產(chǎn)及魚油中n－3系多聚不飽和脂肪酸含量的提高。乳酪的加工過程中需用凝乳酶，來源于小牛的凝乳酶價格昂貴，且過高的溫度會影響奶酪的風(fēng)味，并耗費(fèi)較多能量，而穩(wěn)定性較弱的嗜冷菌凝乳酶有助于解決這一問題。在牛奶冷藏的過程中，需要加入過氧化氫進(jìn)行殺菌，以避免對牛奶中的酶和有益細(xì)菌的損害，而過剩的過氧化氫可以用耐冷的過氧化氫酶來分解。此外還篩選出適于低溫條件下(5℃)制作豆奶凝乳的蛋白酶［30］，比采用來自灰菌素鏈霉菌(Streptomycesgriseinus)的微生物蛋白酶處理過的硬度更高，微生物蛋白酶只產(chǎn)生輕微的凝塊活性。

3.2 冷飲行業(yè)

低溫果膠酶可用來降低果汁的黏度，使終產(chǎn)品變得澄清;β－淀粉酶可部分代替啤酒工藝中的大麥麥芽，降低了啤酒的生產(chǎn)成本，且提高啤酒的香度［31］;對嗜冷酶蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的研究將有利于食品加工中食品的冷凍成型、冷干和濃縮操作等，有望應(yīng)用于冰淇淋生產(chǎn)中［32］。

3.3 烘烤面包

嗜冷蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶可與淀粉直接作用，改進(jìn)面團(tuán)和面包屑的性質(zhì)，減少生面發(fā)酵時間，提高面包質(zhì)量，同時還可保持香味和水分。這些低溫酶的優(yōu)勢不僅體現(xiàn)在其高度專一活性方面，還體現(xiàn)在易失活方面:阻止酶的繼續(xù)反應(yīng)，從而避免了面包瓤結(jié)構(gòu)的改變，不至于使面包變得太軟或太粘。

3.4 肉類加工行業(yè)

低溫蛋白酶有助于肉變嫩，因其在低溫下可作用于肉類中的結(jié)締組織膠原和彈性硬蛋白，在較低pH狀態(tài)(pH4～5)下也具有良好的活性，，是理想的肉類柔嫩酶的潛在來源。木瓜蛋白酶已經(jīng)被應(yīng)用于這一方面，但直到目前，還沒有微生物來源的蛋白酶被成功應(yīng)用于這一方面，這主要是由于作用于結(jié)締組織的酶活性太低［33］。由嗜冷微生物獲得的低溫彈性蛋白酶，有可能應(yīng)用到這方面。

3.5 保健營養(yǎng)品開發(fā)

不飽和脂肪酸如PUFA、GLA、EPA及DHA等具有降血脂、降糖、防癌及健腦益智等生理功效，可作為飲食補(bǔ)充物，以補(bǔ)償必需脂肪酸的不足并恢復(fù)正常的代謝功能。但受氣候、產(chǎn)地、資源及成本的影響，目前PUFA含量不穩(wěn)定，不能滿足人們的需求。而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶在低溫條件下可生物催化合成脂肪酸脂，使其擺脫了原料限制，為油源開發(fā)提供新途徑。

此外，從嗜堿及嗜冷微球菌(Micrococcussp)中獲得一種α－淀粉酶，此酶在低溫和高pH下可將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽四糖(mahotetrose)，是一種麥芽寡糖(maho－oligosacch aride)，已被用于食品添加劑和臨床分析。

4 展望

隨著對嗜冷酶的不斷發(fā)掘，得到的嗜冷酶種類越來越多，對其特性及應(yīng)用的研究也越來越深入。就其結(jié)構(gòu)而言，從最初同嗜溫、嗜熱酶之間同源性模型的結(jié)構(gòu)比對到對其自身晶體三維結(jié)構(gòu)的的觀察。目前，許多來源于高山、極地深海等極端環(huán)境中的低溫酶，包括谷氨酰脂脫氫酶、α－淀粉酶、β－內(nèi)酰胺酶、丙氨酸脫氫酶等的一級結(jié)構(gòu)、基因或表達(dá)蛋白序列功能特性等方面的信息已被獲悉。嗜冷酶的結(jié)構(gòu)多樣，其嗜冷機(jī)制也各不相同，目前尚沒有一種統(tǒng)一的模式結(jié)構(gòu)能很好解釋嗜冷酶的耐冷機(jī)制，尤待我們進(jìn)一步探索。

從應(yīng)用方面看，雖然自然界賦予嗜冷酶低溫下的高催化活性，且已利用基因工程技術(shù)在宿主中得到表達(dá)，但酶的表達(dá)量畢竟有限，且在高溫下的熱敏感性限制了其在生物技術(shù)上的廣泛應(yīng)用。至今只有一小部分嗜冷酶被分離純化并應(yīng)用于生產(chǎn)，因此嗜冷酶還有很大的潛在價值。相信隨著越來越多的嗜冷微生物的分離鑒定、嗜冷酶的分離純化及基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，嗜冷酶將會以更廣闊的來源、更低廉的價格應(yīng)用到食品行業(yè)及其他工業(yè)中。

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