毛梾種子低溫層積過程中內(nèi)源激素的變化及其與發(fā)芽的關(guān)系

李冬林，張亞楠，金雅琴，夏重立

（1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院,江蘇 南京 210038）

毛梾Cornus walteri為我國傳統(tǒng)的木本油料植物，隸屬山茱萸科梾木屬Cornus。其自然分布于我國遼寧南部和華北、華東、中南、西北、西南等地區(qū)[1]。毛梾果實含油率高達31.8%～41.3%，出油率為25%～30%[2]，其油脂不僅可供食用，還可用作機械和鐘表的潤滑油，也是制皂和油漆的好原料；其葉質(zhì)地柔軟，富含營養(yǎng)，制成葉粉，各種畜禽均可利用，是一種良好的木本飼料植物；木材堅硬、紋理細致，是一種良質(zhì)木材，其葉和樹皮可用以提取拷膠，還含有單寧物質(zhì)，可用作染料；亦是綠化和固土樹種和蜜源植物。

毛梾最常用的育苗方法是播種育苗，但是毛梾種實具有明顯的休眠習(xí)性，種皮堅硬，未經(jīng)處理的種子當(dāng)年幾乎不能發(fā)芽，這給生產(chǎn)中實生苗的培育帶來了一定的難度，并成為毛梾天然更新和引種栽培的主要制約因子。近年來，有關(guān)梾木屬種子破除休眠的方法已有研究報道[3-4]，但相關(guān)機制尚不清楚。為此，對毛梾種子低溫層積過程中各種內(nèi)源激素的含量進行了測定，分析了內(nèi)源激素與種子發(fā)芽的關(guān)系，以期為揭示毛梾種子休眠的內(nèi)在機理、促進其引種與繁育而提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試種實采集于江蘇南京中山陵園。種實于2011年10月采集，經(jīng)揉搓、脫肉、沖洗、晾干，獲得純凈的種實5 kg。經(jīng)測定，種實圓球型，內(nèi)果皮淺肉紅色，直徑4.31～5.18 mm，百粒質(zhì)量為 4.336 4～ 4.430 0 g。

試驗于2011年10月至2012年5月在江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院實驗室進行。種實經(jīng)脫肉后采用混沙濕藏處理，將種實和濕沙（含水量40%～45%）按照1∶3的體積比混合后置于0～5 ℃的冷庫中。濕沙為新鮮河沙，并經(jīng)高溫滅菌處理。2011年10月至2012年6月，每月中旬取樣1次，重復(fù)3次，共取樣7次。取樣時將種實自濕沙中篩出，用自來水沖洗，并用吸水紙吸干水分，篩揀，獲得純凈種實（含肉紅色內(nèi)果皮，以下稱為種子）待測。

1.2 內(nèi)源激素的測定

按照四分法從待測種實中取出部分樣品，將硬果皮敲碎獲得白色測試樣品（含胚、胚乳及種皮）0.5～1.0 g。液氮速凍后，加入4 mL 的提取液（80%冷甲醇）冰浴研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL的試管中。搖勻后在4 ℃下放置4 h，3 500 r·min-1離心15 min，取上清液。沉淀中加1 mL的提取液，攪勻，置于4 ℃下再提取1 h，然后離心，合并上清液并記錄體積，棄去殘渣。上清液過C18 固相萃取柱純化。測定方法采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）[5]，所用試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。所有樣品均重復(fù)測定3次，取平均值。應(yīng)用Excel作圖并作統(tǒng)計分析。

1.3 發(fā)芽試驗與結(jié)果測定

將篩揀后的部分純凈種實置于培養(yǎng)箱中作發(fā)芽試驗。將種子均勻播種于盛有濕沙的容器盒中，每盒100粒。播種后覆沙2～3 ㎝，均勻淋水，保證沙床的平整和濕潤，然后蓋膜以保濕。沙床溫度保持在25～30 ℃之間。重復(fù)試驗3次。播種后每天觀察種子發(fā)芽情況，以種子出土作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計發(fā)芽勢及發(fā)芽率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS612 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。采用方差分析方法估算不同處理間的差異顯著性（α＝0.05），試驗結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫層積過程中種子內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律

2.1.1 IAA含量的變化規(guī)律

低溫層積處理過程中毛梾種子IAA含量的變化規(guī)律不明顯（圖1）。未經(jīng)層積處理的種子其IAA含量最高（81.861 ng·g-1），低溫層積處理后的種子其IAA含量降低為81.861 ng·g-1，但層積一段時間（30 d）后其IAA含量開始下降，并于層積120 d時上升到極值（65.751 ng·g-1），但層積處理150 d后其IAA含量又降至試驗期間的最低值（31.141 ng·g-1）。

圖1 低溫層積過程中毛梾種子IAA含量的變化Fig. 1 Change of IAA content in C. walteri seeds during cold stratification

2.1.2 ABA含量的變化規(guī)律

ABA含量變化明顯，整個處理期間呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢（如圖2 A所示）。層積處理開始前，種子中的ABA含量最高（329.406 ng·g-1）；層積處理后，隨著處理時間的延長，ABA含量一直在下降，并在層積處理150 d后降到極值（235.933 ng·g-1），這時ABA的含量是層積處理開始前的0.716倍。盡管在層積處理末期（180 d后）ABA含量有所回升，但ABA含量的變化趨勢是隨著層積處理時間的延長而下降的。

2.1.3 GA1/3含量的變化規(guī)律

GA1/3含量的變化規(guī)律如圖2 B所示。在層積處理初期（0～30 d）GA1/3含量緩慢增加，并在層積處理30 d時出現(xiàn)極值（5.734 ng·g-1）。但在層積處理30 d以后GA1/3含量又開始下降，這種下降的趨勢一直持續(xù)到試驗結(jié)束（180 d）。從GA1/3含量的總體變化趨勢來看，盡管是下降的，但變化一直很平穩(wěn)。

2.1.4 ZRs與iPAs含量的變化規(guī)律

有關(guān)文獻[6]報道，細胞分裂素（CTK）具有促進細胞分裂、抑制器官老化、誘導(dǎo)花芽分化及延緩葉片衰老的作用。毛梾種子細胞分裂素ZRs含量的變化規(guī)律見圖2 C。從總體趨勢來看，其變化幅度很小。在層積處理開始前，毛梾種子中ZRS的含量為11.088 ng·g-1；層積90 d后，ZRS含量有所下降，并出現(xiàn)了低谷（10.019 ng·g-1），隨后又開始小幅升高；在層積150 d后，ZRS的含量為11.001 ng·g-1，隨后又出現(xiàn)小幅的下降。

iPAs含量的變幅相對較大（如圖2 D所示）。在整個層積處理期內(nèi)，出現(xiàn)了2次上升2次下降的變化過程，其變化曲線略呈“M”形。在層積處理開始時，iPAs含量（3.553 ng·g-1）為整個層積處理期內(nèi)的最低值；隨后開始上升，并于層積處理30 d后升至極值（5.937 ng·g-1），隨后開始下降；層積處理90 d時，iPAs含量降為4.557 ng·g-1；層積處理120 d后，再次升至最大值（7.124 ng·g-1）；隨后開始降低，并一直持續(xù)到試驗結(jié)束。

圖2 低溫層積過程中毛梾種子ABA、GA1/3、ZRs和iPAs含量的變化Fig. 2 Changes of ABA, GA1/3, ZRs and iPAs contents in C. walteri seeds during cold stratification

2.2 低溫層積處理過程中毛梾種子中5種內(nèi)源激素含量比值的變化規(guī)律

許多研究結(jié)果表明，不同植物激素對植物生理活動的影響不是孤立地發(fā)生作用的，而是既相互制約又相互促進的[7-8]。毛梾種子中IAA、GA1/3、ZRs、iPAs的平均值及其與ABA的比值見圖3。

IAA/ABA的變化趨勢與IAA含量的變化趨勢基本相似（圖3 A）。層積處理開始時IAA與ABA的比值最大，出現(xiàn)了最大比值（0.248），隨后下降并出現(xiàn)低谷（0.141）。層積處理30 d后，IAA/ABA開始上升，一直延續(xù)到120 d，這時的比值增加到0.231，隨后又重新出現(xiàn)了短時的下降趨勢（處理后150 d，IAA/ABA為0.132）。相對而言，GA1/3/ABA比值在整個層積處理期內(nèi)波動較小。層積處理初期GA1/3/ABA的比值很低（0.015 7），但隨著層積處理時間的延長而迅速增加；在層積處理30 d時測得的GA1/3與ABA的比值為0.019 3；其后隨著層積處理時間的延長其比值一直很平穩(wěn)地變化著（如圖3 B所示）。

ZRs/ABA比值的變化趨勢如圖3 C所示。由圖3 C可知，在層積處理前期ZRs/ABA比值的變化平穩(wěn)。低溫層積處理120 d后，其比值開始增加，并于層積處理150 d后上升到極值（0.046 6）。而iPAs/ABA的變化趨勢與iPAs含量的變化趨勢類似，在整個試驗處理期間出現(xiàn)了2次上升和2次下降的變化過程（圖3 D）。在層積處理開始時，iPAs/ABA為0.010 8，此為整個處理期內(nèi)的最低值；隨后開始上升，層積處理30 d后升至0.020 0，隨后開始下降，在層積處理90 d時，其比值降為0.016；在層積處理150 d后其比值又升為整個試驗期間的最大值（0.027 8）；隨后又有所降低，并一直持續(xù)到試驗結(jié)束。

圖3 低溫層積過程中毛梾種子中的IAA、GA1/3、ZRs、 iPAs和ABA比值的變化Fig. 3 Changes of ratios of IAA, GA1/3, ZRs, iPAs to ABA in C. walteri seeds during cold stratification

2.3 不同低溫層積處理種子的各發(fā)芽指標(biāo)值

發(fā)芽試驗結(jié)果表明，不同層積處理時間對種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢均有顯著影響（表1）。方差分析結(jié)果表明，不同層積處理時間下毛梾種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢的差異均極顯著（P＜0.01）。未經(jīng)層積處理的干藏種子其發(fā)芽率與發(fā)芽勢均為0，說明干藏種子存在嚴(yán)重的發(fā)芽障礙。從表1中還可以看出，層積處理30 d后，毛梾種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢均不足10%，可見，短期的沙藏層積處理尚不能解除種子的深休眠。隨著層積處理時間的延長，種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢均明顯上升。低溫層積處理120與150 d后種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢的變化均不顯著，以層積處理180 d的發(fā)芽率與發(fā)芽勢分別為41.34%和36.13%，均為最大值。經(jīng)過層積處理的種子，種子休眠逐步被解除，其發(fā)芽率與發(fā)芽勢均明顯增加?？梢姡蜏貙臃e處理對解除毛梾種子的休眠十分奏效。

表1 不同層積處理時間種子各發(fā)芽指標(biāo)值?Table 1 Germination indexes of seeds at different durations of stratification treatment

2.4 低溫層積過程中毛梾種子內(nèi)5種內(nèi)源激素的含量及其比值與種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢的相關(guān)性

低溫層積過程中毛梾種子中5種內(nèi)源激素含量及其比值與種子各發(fā)芽指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果見表2。從表2中可以看出，IAA含量與IAA/ABA比值之間呈極顯著的正相關(guān)(p＜0.01)，但與iPA含量、ZRS/ABA比值、iPA/ABA比值之間均呈負(fù)相關(guān)，但其相關(guān)性不顯著（p＞0.05）；ABA含量與ZRS/ABA比值之間呈極顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與iPA/ABA比值間呈顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.05）；iPA含量與iPA/ABA比值之間呈極顯著的正相關(guān)（p＜0.01），iPA/ABA與ZRS/ABA兩個比值間也呈顯著的正相關(guān)(p＜0.05)。這一結(jié)果說明，毛梾種子中各種激素間存在一定的相關(guān)性。

表2 5種內(nèi)源激素含量及其比值與種子各發(fā)芽指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果?Table 2 Relationship analysis of five kinds of endogenous hormones contents in seeds and their ratios and seeds germination indexes

從5種激素與種子各發(fā)芽指標(biāo)的相關(guān)性來看，ABA含量與種子發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），與發(fā)芽勢呈極顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.01），其相關(guān)系數(shù)分別為0.870、0.892。GA1/3含量與種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢間均呈顯著的負(fù)相關(guān)（p＜0.05），其相關(guān)系數(shù)分別為0.850、0.867。這一分析結(jié)果說明，種子內(nèi)ABA含量與GA1/3含量對種子發(fā)芽的影響最為明顯。

3 結(jié)論與討論

在許多物種中，內(nèi)源激素ABA涉及種子休眠狀態(tài)的誘導(dǎo)與維持[9-10]，對種子內(nèi)胚的發(fā)育、RNA和蛋白質(zhì)合成都起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是控制種子休眠的主要因素[11]，可能會降低胚的吸水能力和滲透勢，阻礙胚根的伸長，抑制種子的萌發(fā)[12]。本研究結(jié)果表明，在整個低溫層積處理過程中，毛梾種子內(nèi)ABA含量隨著時間的變化總體上是減少的，這與肉蓯蓉Cistanche deserticola[13-14]、珙桐Davidia involucrata[15]、紫椴Tilia amurensis[16]、 青 錢 柳Cyclocarya paliurus[17]等深休眠植物種子的試驗結(jié)果基本相似。隨著低溫層積處理時間的延長，休眠種子中的ABA含量下降，這也許是種子萌發(fā)前的啟動信號，對于維持種子中內(nèi)涵物的生理反應(yīng)，逐漸解除休眠起到了關(guān)鍵作用。

有關(guān)IAA在解除種子休眠方面的作用有不同的研究報道。一種研究結(jié)果表明，在層積處理中，休眠種子中的IAA含量上升，這對休眠的解除起到了一定的促進作用。如Kochankov等人[18]認(rèn)為，IAA參與了休眠調(diào)節(jié)；楊萬霞等人[17]研究認(rèn)為，青錢柳種子在層積處理中其IAA含量總體呈上升趨勢，這對解除其休眠有利。另有一些研究結(jié)果表明，種子休眠與IAA含量的關(guān)系不大，過高的IAA含量甚至?xí)鹭?fù)面作用。如李金克等人[19]研究認(rèn)為，高濃度的IAA對紅松Pinus koraiensis種子發(fā)芽不利；高紅兵等人[20]在對東北紅豆杉Taxus cuspidata的研究中發(fā)現(xiàn)，種子層積過程中少量IAA的增加是由胚生長而引起的，IAA與其休眠和萌發(fā)的關(guān)系不大；黃丹等人[21]在研究美國桂花Osmanthus americanus時也發(fā)現(xiàn)，美國桂花種子在層積過程中其IAA含量的變化規(guī)律不明顯。本文的研究結(jié)果表明，低溫層積處理前期毛梾種子中的IAA含量是增加的，但其達到一定高度后又有所下降。因此認(rèn)為，作為促進劑的IAA在解除毛梾種子休眠過程中起到了一定的作用，但其作用規(guī)律及機理尚待進一步研究。

目前的研究結(jié)果表明，用GA處理種子可有效促進種子的萌發(fā)[22]。洑香香等人[23]的研究結(jié)果表明，GA3浸泡結(jié)合層積處理可有效解除山茱萸Cornus officinalis種子休眠。王寧等人[24]的研究結(jié)果表明，用400 mg·L-1GA浸泡冬青Ilex purpurea種子48 h可顯著提高GA、CTK和IAA含量，顯著降低ABA含量，從而促進種子萌發(fā)。因此，林木種子的休眠與萌發(fā)可能取決于內(nèi)源生長抑制劑和生長激素劑之間的平衡力。Wareing與 Saunders[25]研究認(rèn)為，GA1/3通過與ABA和環(huán)境因子的復(fù)雜作用來調(diào)節(jié)休眠的釋放和種子的萌發(fā)。但Bewley[26]認(rèn)為，GA1/3并不參與對休眠本身的調(diào)控，而對促進和維持發(fā)芽起作用，能拮抗ABA。試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著層積處理時間的延長，毛梾種子中的GA1/3與ABA含量間呈負(fù)相關(guān)性，盡管相關(guān)性不十分顯著，但也表明了兩者間存在一定的拮抗關(guān)系。而ZRs/ABA比值的變化基本上呈現(xiàn)出緩慢增加的趨勢，因此認(rèn)為，ZRs在打破毛梾種子休眠、促進種子萌發(fā)上起到了一定的作用，這種作用也可能是通過ABA和GA1/3的平衡和拮抗來調(diào)節(jié)控制的。

植物種子休眠及休眠的解除是十分復(fù)雜的生理現(xiàn)象，內(nèi)源激素的變化及其相互關(guān)系是控制休眠的內(nèi)因，而外部環(huán)境條件的變化是其外因[27]。低溫層積處理目前仍是解除種子深休眠的主要手段。發(fā)芽試驗結(jié)果表明，種子經(jīng)過層積處理后，其發(fā)芽率與發(fā)芽勢均明顯上升，并隨處理時間的延長而增加，而未經(jīng)低溫層積處理的種子其發(fā)芽率為0，說明低溫層積處理對毛梾種子深休眠的解除效果十分明顯。但是，對于不同植物的種子及不同的處理方式，以層積處理解除休眠所需的時間是不同的。例如銀杏Ginkgo biloba因其存在生理休眠，需要低溫層積處理90 d才能解除其休眠，而美國山核桃Caraya illinoensis則需要低溫層積處理30～150 d才能順利發(fā)芽[28]。本試驗結(jié)果說明，低溫層積120與150 d種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢的變化均不顯著，而層積處理180 d后毛梾種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢均明顯上升，分別達到41.34%和36.13%。由此推斷，要有效解除毛梾種子的深休眠，至少要低溫層積處理150 d以上。本研究結(jié)果可為此類植物實生苗培育過程中的種子播種前的預(yù)處理提供參考依據(jù)。

[1] 《中國樹木志》編輯委員會.中國樹木志[M].第2卷.北京:中國林業(yè)出版社,1985:1686－1687.

[2] 柳 鎏,孫醉君.中國重要經(jīng)濟樹種[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1986:148－150.

[3] 康永祥,贠玉潔,趙寶鑫,等.毛梾種子萌發(fā)特性及幼苗生長規(guī)律研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2012,27(3):62－67.

[4] 王曉光,李 蔚,劉先貴.光皮毛梾種子催芽技術(shù)研究[J].湖北林業(yè)科技,2007,(4):26－28.

[5] 李宗庭,周 燮.植物激素及其免疫檢測技術(shù)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1996.

[6] 唐定臺,徐民新,馮永紅.石竹試管花的誘導(dǎo)及其影響因子的研究[J].園藝學(xué)報,1996,23(3):277－280.

[7] Khan A. Primary, preventive and permissive role of hormones in plant systems[J]. Bot Rev, 1975, 41:391－420.

[8] 曹幫華,蔡春菊.銀杏種子后熟生理與內(nèi)源激素變化的研究[J].林業(yè)科學(xué),2006,42(2):32－37.

[9] Leubner-Metzger G. Functions and regulation of b-1,3-glucanase during seed germination, dormancy release and after-ripening[J].Seed Sci Res, 2003, 13:17－34.

[10] Nambara E, Marion Poll A. ABA action and interactions in seeds[J].Trends Plant Sci, 2003,8:213－217.

[11] 韓明玉,張滿讓,田玉命.植物激素對幾種核果類種子休眠破除和幼苗生長的效應(yīng)研究[J].西北植物學(xué)報, 2002, 22(6):1348－1354.

[12] 付婷婷,程紅焱,宋松泉.種子休眠的研究進展[J].植物學(xué)報,2009, 44(5): 629－641.

[13] 陳慶亮,王華磊,王志芬,等.低溫層積與外源GA3對肉蓯蓉種子萌發(fā)及其內(nèi)源GA和ABA含量的影響[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(3):270－272.

[14] 牛東玲,宋玉霞,郭生虎.肉蓯蓉種子休眠與萌發(fā)特性的初步研究[J].種子,2006,25(2): 17－21.

[15] 雷濘菲,彭書明,牛 蓓.珍稀瀕危植物珙桐種子休眠萌發(fā)過程中內(nèi)源激素的變化[J].廣西植物,2009,29(1):66－69.

[16] 楊立學(xué),王海南,張 琳.低溫層積過程中紫椴種子內(nèi)源激素含量的變化[J].經(jīng)濟林研究,2012,30(2):15－18.

[17] 楊萬霞,方升佐.青錢柳種子綜合處理過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2008, 32(5):85－88.

[18] Kochanko V G, Gitzesik M, Chojnowsk M,et al.Effect of temperature, growth regulators and other chemicals onEchinacea purpurea(L) Moench seed germination and seedling survival[J].Seed Sci ＆ Technol, 1998,26: 547 － 554.

[19] 李金克,金幼菊,陳華君,等.紅松種子層積催芽處理和萌發(fā)過程中內(nèi)源GA和IAA含量的變化[J].河北林果研究, 1997,12(3):203－208.

[20] 高紅兵,昊榜華,孫振良.東北紅豆杉層積過程中內(nèi)源生長素和脫落酸含量的變化[J].吉林林學(xué)院學(xué)報, 1998, 14(4):187－189.

[21] 黃 丹,許岳香,胡海波.美國桂花種子低溫層積過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化[J].林業(yè)科技開發(fā),2010,24(1):53－56.

[22] 余朝霞,黃雪群. GA對林木種子萌發(fā)的調(diào)控研究進展[J].浙江林業(yè)科技,2003,23(1):73－77.

[23] 洑香香,周曉東,劉紅娜.山茱萸種子休眠機理與解除方法初探[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(4):7-13.

[24] 王 寧,梅海軍,袁美麗,等.赤霉素浸種和變溫層積過程對冬青種子激素含量的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 44(5)524－527.

[25] Wareing PF, Saunders PF. Hormones and dormancy[J]. Annu Rev Plant Physiol, 2003, 22:261－288.

[26] Bewley JD. Seed germination and dormancy[J]. Plant Cell, 1997,9:1055－1066.

[27] 王友鳳,馬祥慶.林木種子萌發(fā)的生理生態(tài)學(xué)機理研究進展[J].世界林業(yè)研究,2007,20(4):19－23.

[28] 管康林.樹木種子休眠性狀的研究綜述[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,1986,3(2):99－109.