外源ABA對低溫脅迫下冬小麥細胞膜脂組分及膜透性的影響

王軍虹，徐 琛，蒼 晶 ，于 晶，張成亮，王 興，王健飛，王祖建，蒼 煒

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

低溫脅迫下，外源ABA可提高植物抗寒性，增強根部水的疏導作用，并保護膜的完整性，增強植物對低溫的忍耐力[1]。外源ABA對植物抗寒性的調(diào)節(jié)已在水稻、番茄、辣椒、玉米等多種植物上被證實。適宜濃度的ABA處理小麥[2]，可使其在不抑制生長的情況下提高抗寒力，對抗寒性強的品種效果明顯。植物受逆境脅迫時，細胞膜是其傷害的原初位點，當?shù)蜏孛{迫達到一定相變溫度時，導致膜脂由流動性的液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫w固態(tài)相，膜透性增大，細胞液外滲，具體表現(xiàn)為電導率增大及MDA含量增加，而植物抗寒性強的品種其膜脂相變溫度明顯低于抗寒性弱的品種，其膜脂不飽和程度高于抗寒性弱的品種[3]。Suzuki等報道冬小麥葉片中各種細胞器的抗凍能力與不飽和脂肪酸指數(shù)及亞麻酸含量關(guān)系密切[4-5]，水稻、油菜等植物有類似結(jié)果。

黑龍江省地處北溫帶寒冷地區(qū)，冬季嚴寒，是冬小麥種植禁區(qū)。東農(nóng)冬麥1號是東北農(nóng)業(yè)大學選育的能在-30℃極端低溫氣候下安全越冬的強抗寒冬小麥品種。于晶、劉麗杰等曾對外源ABA處理后越冬期東農(nóng)冬麥1號的丙二醛、糖代謝、過氧化物酶類等相關(guān)指標進行分析[6-7]。但極寒條件下外源ABA對冬小麥膜質(zhì)脂肪酸組分的影響與抗寒性的關(guān)系等相關(guān)研究未見報道。本研究以強抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號和冷敏感品種濟麥22為材料，對封凍后自然降溫條件下冬小麥葉片及分蘗節(jié)膜質(zhì)脂肪酸組成的變化及膜損傷程度進行系統(tǒng)分析，為揭示冬小麥膜脂抗寒機制及指導生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冬小麥東農(nóng)冬麥1號由東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供；濟麥22為黃淮麥區(qū)主栽小麥品種，其抗寒能力弱于東農(nóng)冬麥1號，在黑龍江省種植返青率小于2%。

1.2 試驗試劑

ABA純品及脂肪酸標準品均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

試驗于2011年9月～2012年2月在東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地田間進行。2011年9月8日播種，完全區(qū)組設(shè)計，3次重復，小區(qū)行長2 m，行距0.2 m，10行區(qū)。播種量450?！-2，播深為5 cm，常規(guī)田間管理。麥苗長至三葉期，對其葉片噴施1×10-5mol·L-1ABA，噴施量為每4 m2·L-1（ABA處理組），以噴施等量的蒸餾水為對照組。取樣時間分別為10 d最低溫平均4℃（2011年10月12日）、0℃（2011年11月9日）、-10℃（2011年11月30日）和-25℃（2012年1月3日）（見圖1），每個品種隨機選取長勢一致的麥苗50株，將分蘗節(jié)和葉片剪成0.5 cm小段，分別混勻，置-80℃冰箱備用。

圖1 各取樣日溫度變化Fig.1 Changes of temperatures when sampling

膜質(zhì)成分及含量測定：取鮮樣1 g，105℃高溫熱殺10 min，在氯仿-甲醇（1∶1，V/V）中研磨、提取、過濾。然后加0.76%NaCl于濾液中，充分混合分層后取下層，經(jīng)真空蒸干得總類脂。液-液分離法除去中性脂，得極性脂。真空抽干后加1 mL 0.4 mol·L-1氫氧化鉀的甲醇溶液和1 mL苯-石油醚（1∶1，V/V），然后加8 mL蒸餾水，渦旋混勻。靜置分層后，取上層減壓濃縮，于氣質(zhì)聯(lián)用儀6890N-5973上，進行色譜分析。

色譜條件：毛細管柱：007-CW；柱溫（程序升溫）：150℃（1 min）經(jīng)15 min到200℃，再經(jīng)2 min升至250℃，維持5 min。汽化室和檢測器溫度：270℃。面積歸一法定量。膜脂不飽和程度指標按下式計算：

不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸含量（Unsaturated/saturated）=[（18∶1）+（18∶2）×2+18∶3）×3]/[（16∶0）+（18∶0）]；

脂肪酸不飽和指數(shù)（Index of unsaturated fatty acid）=[（18∶1）+（18∶2）×2+18∶3）×3]；

公式中小括號內(nèi)的數(shù)值代表不同的脂肪酸。

丙二醛（Malondialdenhyde）含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；膜透性測定采用電導法測定相對電導率[8]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007進行圖形處理，運用DPS7.05軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA對低溫脅迫下冬小麥葉片膜脂脂肪酸組分的影響

兩種冬小麥脂肪酸組分主要有棕櫚酸（16∶0）、硬脂酸（18∶0）、油酸（18∶1）、亞油酸（18∶2）和亞麻酸（18∶3）五種。對照組亞麻酸含量最高，約占總脂肪酸含量的70%，其次是棕櫚酸，約占12%，亞油酸、硬脂酸和油酸共占約17%；處理組中，亞麻酸約占總脂肪酸的76%，棕櫚酸約占10%，亞油酸、硬脂酸和油酸約占13%（見圖2）。

圖2 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥葉片膜脂脂肪酸含量的影響Fig.2 Effect of exogenous ABA on membrane fatty acid content in leves of winter wheat under low temperature stress

由圖2可知，隨著溫度降低，兩個小麥品種棕櫚酸含量在兩個試驗組中（ABA處理組和對照組）均呈逐漸上升趨勢；對照組中，棕櫚酸含量在各個時期均表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號高于濟麥22，處理組中，棕櫚酸含量在4和0℃表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號低于濟麥22。亞麻酸含量在兩個試驗組中的兩個小麥品種中均呈逐漸下降趨勢；對照組中東農(nóng)冬麥1號含量始終低于濟麥22，并在4和0℃達到差異極顯著（P＜0.01）；處理組中，亞麻酸含量始終表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號高于濟麥22，并在各個溫度下都達到差異極顯著（P＜0.01），而濟麥22在-10℃差異不顯著（見圖2）。

總的來說，外源ABA使兩個小麥品種的棕櫚酸和亞麻酸含量發(fā)生改變，從而響應(yīng)低溫脅迫，且對強抗寒品種東農(nóng)冬麥1號脂肪酸組分的影響更為顯著。

2.2 外源ABA對低溫脅迫下冬小麥葉片脂肪酸飽和度的影響

在自然降溫過程中，兩種冬小麥葉片中的U/S值均在84%以上，兩個試驗組（ABA處理組和對照組）兩個小麥品種中的IUFA和U/S值均呈下降趨勢（見圖3、4）。其中對照組中IUFA和U/S值表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號中低于濟麥22。而處理組在4和0℃下表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號高于濟麥22，且4℃達最大值84%。說明，外源ABA能夠使兩種冬小麥葉片膜脂U/S值升高，相變溫度降低，且對抗寒性強的東農(nóng)冬麥1號的膜脂不飽和度提高更為顯著。

圖3 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥葉片不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸含量的影響Fig.3 Effect of exogenous ABA on contents of unsaturated fatty acid/saturated fatty acid of winter wheat leaves under low temperature stress

圖4 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥葉片IUFA的影響Fig.4 Effect of exogenous ABA on IUFA of winter wheat leaves under low temperature stress

2.3 外源ABA對低溫脅迫下冬小麥分蘗節(jié)膜脂脂肪酸組分的影響

兩種冬小麥分蘗節(jié)中的脂肪酸組成與葉片相同，但含量不同。隨著溫度降低，對照組中棕櫚酸、亞麻酸含量分別約占總脂肪酸含量的17%、60%，硬脂酸、油酸、亞油酸占23%；處理組中，棕櫚酸、亞麻酸分別占總脂肪酸含量的15%、62%，硬脂酸、油酸和亞油酸共占約27%（見圖5）。

圖5 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥分蘗節(jié)膜脂脂肪酸含量的影響Fig.5 Effects of exogenous ABA on membrane fatty acid content in tillering node of winter wheat under low temperature stress

在自然降溫過程中，棕櫚酸含量在處理組和對照組中始終表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號顯著高于濟麥22，在處理組中，兩個小麥品種棕櫚酸含量均較對照組低。而亞麻酸含量在兩個試驗組中均表現(xiàn)為東農(nóng)冬麥1號高于濟麥22，在兩個小麥品種中的含量均為處理組高于對照組，且在處理組中，東農(nóng)冬麥1號亞麻酸含量在整個降溫期逐漸上升，并達到差異極顯著；而弱抗寒性品種濟麥22呈“先升后降”，-10℃達到最大值，而其在處理組中含量呈逐漸升高趨勢，并在-25℃達到最大值。

2.4 噴施外源ABA后不同低溫脅迫下冬小麥分蘗節(jié)脂肪酸不飽和程度的變化

自然降溫條件下，東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)的IUFA、U/S值呈逐漸升高趨勢，且不飽和比例在-25℃達到最高值83%，而弱抗寒性品種濟麥22則呈“低-高-低”的趨勢，0℃達到最高72%，隨后下降（見圖6、7），在這一時期，東農(nóng)冬麥1號U/S值始終大于濟麥22，表明在-25℃嚴寒條件下東農(nóng)冬麥1號仍可積累相對較多的不飽和脂肪酸，而濟麥22不飽和脂肪酸合成在0℃受阻，IUFA在-25℃達最低。處理組中，兩種冬小麥分蘗節(jié)中不飽和脂肪酸含量均有升高，東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)中U/S值、IUFA始終大于濟麥22，呈逐漸升高趨勢，且在-25℃達到最高；而處理組中濟麥22的U/S值在0℃下降后在-10和-25℃升高，表明經(jīng)外源ABA噴施在相同條件下濟麥22也能在-25℃積極響應(yīng)脅迫，從而使其U/S值維持較高水平，但其增加幅度始終較東農(nóng)冬麥1號小，說明外源ABA對抗寒性較強的東農(nóng)冬麥1號膜脂穩(wěn)定性的增強效果，比冷敏感的濟麥22更為顯著。

圖6 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥分蘗節(jié)不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸含量的影響Fig.6 Effects of exogenous ABA on contents of unsaturated fatty acid/saturated fatty acid of winter wheat tillering node under low temperature stress

圖7 低溫脅迫下外源ABA對冬小麥分蘗節(jié)IUFA的影響Fig.7 Effects of exogenous ABA on contents of IUFA of winter wheat tillering node under low temperature stress

2.5 外源ABA對低溫脅迫下冬小麥細胞膜透性的影響

由圖8a、b可見，隨著溫度降低，兩個小麥品種MDA含量逐漸積累，在-25℃達到最高，且濟麥22 MDA含量高于東農(nóng)冬麥1號，說明東農(nóng)冬麥1號抗寒性強于濟麥22。處理組MDA含量也隨著溫度的降低逐漸升高，且在整個脅迫過程中差異顯著，說明田間自然降溫下，冬小麥葉片和分蘗節(jié)的膜脂過氧化程度加劇，過氧化產(chǎn)物積累，其中葉片MDA積累高于分蘗節(jié)，表明ABA對緩解東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)膜脂過氧化、維持膜的穩(wěn)定性較濟麥22更明顯。

圖8 不同低溫處理下冬小麥葉片和分蘗節(jié)相對電導率、MDA含量的變化Fig.8 Change of MDA contents and relative electrolytic conductivity of winter wheat leaves and tillering node under low temperature stress

由圖8c、d可見，隨著溫度降低，東農(nóng)冬麥1號和濟麥22葉片和分蘗節(jié)相對電導率均逐漸增大，且相同溫度下，東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)相對電導率始終低于濟麥22，表明東農(nóng)冬麥1號對低溫適應(yīng)能力強于濟麥22，而處理組中兩個品種的相對電導率影響不一致，ABA明顯降低東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)的相對電導率，但對濟麥22影響較小。

3 討論

3.1 兩個小麥品種膜質(zhì)脂肪酸組分含量與抗寒性的關(guān)系

細胞膜是植物接受外界環(huán)境信息的受體，膜脂肪酸組成變化是植物抵抗環(huán)境脅迫的基本反應(yīng)?？购参镏员憩F(xiàn)為抗寒力強，從膜脂結(jié)構(gòu)的角度來看，原因一是抗寒植物在長期對溫度的適應(yīng)過程中，本身具有較多的不飽和脂肪酸；二是在低溫逆境下，具有較強抗寒性的植物能夠在膜脂中優(yōu)先積累較多的不飽和脂肪酸并使之迅速參與膜的結(jié)構(gòu)以適應(yīng)低溫的生理需要[9]，這在水稻幼苗[10]、大豆[11]、苜蓿[12]中均有證明。本試驗在大田自然降溫條件下，兩個小麥品種葉片不飽和脂肪酸比例呈逐漸降低趨勢，在極度嚴寒條件下未能積極響應(yīng)環(huán)境脅迫，這主要是小麥葉片裸露在地面上，未得到保護，溫度急劇下降，造成其細胞膜結(jié)構(gòu)損傷嚴重，導致逐漸干枯，失去生命力。而分蘗節(jié)處于地下，有雪覆蓋保護，在低溫條件下能夠維持一定活力，其不飽和脂肪酸積累隨溫度降低持續(xù)上升，并在-25℃達到峰值，能持續(xù)響應(yīng)低溫脅迫。

抗寒性較強的小麥品種東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)中不飽和脂肪酸含量比耐寒性弱的濟麥22含量高，強抗寒性品種東農(nóng)冬麥1號亞麻酸含量顯著高于弱抗寒性品種濟麥22；東農(nóng)冬麥1號棕櫚酸含量低于濟麥22，說明隨著溫度降低，冬小麥亞麻酸和棕櫚酸積累是影響抗寒力的主要因子，膜脂脂肪酸組分及含量體現(xiàn)冬小麥長期對低溫的適應(yīng)而形成遺傳差異。本研究得到的冬小麥抗寒指示性脂肪酸與前人對其他植物種類的研究有異，如在苜蓿葉片[12]、大豆葉片線粒體膜中[13]均以亞麻酸和棕櫚酸作為抗寒指示性脂肪酸，而在水稻干胚膜中則是以亞油酸和油酸作為抗寒指示性脂肪酸[14]，葡萄莖膜是以棕櫚酸和亞油酸為指示性脂肪酸[15]，李永華等對秋菊葉片進行研究[16]，確定亞麻酸與“亞油酸+油酸”的比值差異顯著，說明低溫條件下，不同物種間脂肪酸生理代謝特征存在差異。但這都是其對低溫環(huán)境較強適應(yīng)的一種表現(xiàn)，可作為鑒別品種間耐寒性差異的有效指標。

3.2 外源ABA對兩個小麥品種不飽和脂肪酸含量的影響

植物激素是植物體生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是植物對不同逆境產(chǎn)生響應(yīng)的信號分子，廣泛參與逆境等各種生理過程的調(diào)節(jié)。外源植物激素或者其他物質(zhì)能夠改變處于低溫脅迫的植物對環(huán)境的適應(yīng)能力，改變生物膜性質(zhì)，如外源甾醇有助于提高飽和脂肪酸含量，從而穩(wěn)定細胞膜中由鹽脅迫引起的傷害、調(diào)節(jié)細胞膜的功能及膜結(jié)合的H+-ATPase活性[17]，而外源Ca2+處理能關(guān)閉膜上的鈣離子通道，具有維持細胞壁結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定細胞膜功能的作用[18]。同時噴施不同濃度ABA能夠?qū)η炎佑酌缟锬は到y(tǒng)起緩解作用[15]，有效緩解低溫脅迫對細胞膜的影響[19]。本研究結(jié)果表明，低溫條件下，經(jīng)外源ABA處理均使兩個小麥品種不飽和脂肪酸含量明顯提高，最為顯著的是噴施外源ABA后，東農(nóng)冬麥1號在零上的低溫脅迫下不飽和脂肪酸由未處理時低于濟麥22變?yōu)楦哂跐?2，這主要是ABA的噴施有利于其亞麻酸的積累，因此在葉片和分蘗節(jié)中都較未處理組提高，IUFA也相應(yīng)提高,從而使膜脂的相變溫度相應(yīng)降低，說明噴施外源ABA對兩種小麥不飽和脂肪酸的積累有促進作用，進而提高抗寒力，在強抗寒品種東農(nóng)冬麥1號中尤為明顯，這與黃杏、付翀等研究結(jié)果[19-20]一致。在本試驗中，噴施ABA對零上溫度下兩種小麥葉片不飽和指數(shù)的提高也較為顯著，外源施加ABA對脂肪酸的不同影響效果還與溫度有關(guān)，低溫脅迫下兩種小麥膜脂肪酸不飽和度的升高是ABA直接作用的結(jié)果。

3.3 外源ABA對兩個小麥品種細胞膜傷害程度的影響

本研究表明，隨著低溫脅迫時間的延長，兩個小麥品種膜脂過氧化作用加劇，MDA大量積累，導致膜透性增大，細胞膜內(nèi)大量電解質(zhì)外滲，從而電導率增加。經(jīng)外源ABA處理，兩個小麥品種過氧化作用均減輕，減少了對細胞膜的傷害，這是外源ABA提高冬小麥抗寒性的生理基礎(chǔ)，本研究結(jié)果與黃杏、孫富等研究結(jié)果[19-21]一致。說明ABA能夠減輕低溫脅迫下冬小麥膜脂過氧化程度和氧化傷害，且ABA對不同物種間的影響也有差異。

低溫造成植物細胞膜系統(tǒng)的破壞，源于生物自由基傷害學說[22]，由于活性氧的毒害作用，植物體內(nèi)形成一套清除活性氧自由基的抗氧化保護機制，其中保護酶類SOD、POD、CAT等對活性氧和過氧化產(chǎn)物清除有重要作用，可抵御活性氧傷害。植物抗氧化系統(tǒng)受ABA信號系統(tǒng)的誘導和調(diào)控，而抗氧化保護系統(tǒng)的增強與脅迫的耐性密切相關(guān)[23]。本研究表明，在ABA信號系統(tǒng)的誘導和調(diào)控下，膜脂脂肪酸含量變化也與植物細胞膜的穩(wěn)定性密切相關(guān)。在極寒條件下，高比例的不飽和脂肪酸，增加膜脂中不飽和脂肪酸含量和不飽和程度，能有效降低膜脂的相變溫度，維持流動性，使植物不受傷害，與膜保護酶類共同在耐寒植物的越冬過程中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，植物在對低溫環(huán)境的長期適應(yīng)過程中，除結(jié)構(gòu)發(fā)生變化外，還產(chǎn)生一些生理適應(yīng)機制。如產(chǎn)生與環(huán)境相適應(yīng)的膜脂變化，使其能適時防御低溫逆境造成的傷害。植物對低溫的耐受性與外源ABA提高細胞膜脂肪酸的相變溫度，增加其不飽和度等變化有關(guān)。

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