大腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺檢測方法研究

張慶云，李佳林，鄭 培，李艷霞，車雨軒，董曉東

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

大腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺檢測方法研究

張慶云，李佳林，鄭 培，李艷霞，車雨軒，董曉東

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

多巴胺是人腦中一種特殊的神經(jīng)傳遞介質(zhì)，其含量的異常變化將導(dǎo)致一些臨床病癥的出現(xiàn)，例如帕金森病。因此如何簡單快速地檢測多巴胺成為全世界研究者們關(guān)注的課題。常用的檢測方法有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)熒光法、液相色譜法和電化學(xué)方法等，現(xiàn)對近幾年有關(guān)多巴胺檢測方法的研究作一綜述。

多巴胺；神經(jīng)遞質(zhì)；帕金森病；檢測

多巴胺（dopamine, DA）是一種存在于神經(jīng)組織和體液中的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是腦功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。它在人腦中特定區(qū)域的含量分布影響著垂體內(nèi)分泌機(jī)能的協(xié)調(diào)，而且直接與神經(jīng)活動有關(guān)。腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)功能失調(diào)是精神分裂癥和帕金森氏癥的重要原因。此外，多巴胺還具有興奮心臟、增加腎血流量的功能，用于治療缺血性、心源性及感染性休克。因此, 開展多巴胺分析方法的研究在神經(jīng)生理機(jī)能、疾病診斷及相關(guān)藥物的質(zhì)量控制等方面有著重要意義。

1 分光光度法

陳家柏等[1]用分光光度法測定了血液中微量多巴胺的濃度。該方法采用硫酸亞鐵-酒石酸鹽溶液為顯色劑，在520 nm處測定吸光度，結(jié)果顯示在2～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，鹽酸多巴胺的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。在臨床中對腎功能不全患者進(jìn)行血液透析時，為了防止部分患者出現(xiàn)低血壓，通過微泵持續(xù)給予多巴胺，常用劑量下的血液中多巴胺的濃度位于此線性范圍之內(nèi)。這為臨床血液透析中調(diào)整多巴胺輸入劑量提供了理論依據(jù)。龍云等[2]利用荷移反應(yīng)，采用四氯苯醌為顯色劑，在480 nm處測定吸光度，用該方法測定了食品中多巴胺的含量。潘自紅等[3]研究了在堿性的氨水溶液中，F(xiàn)eCl3與鹽酸多巴胺反應(yīng)生成紫紅色配合物，該配合物最大吸收波長為507 nm，絡(luò)合比為1∶2。體系的吸光度與鹽酸多巴胺的濃度在20.0～220 mg/L呈良好的線性關(guān)系，建立了測定鹽酸多巴胺的新方法，該方法能夠直接用于注射液中鹽酸多巴胺的測定。

2 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光方法因具有靈敏度高、儀器簡單、快速等特點越來越受到人們的重視，在分析工作中得到廣泛的應(yīng)用。王術(shù)皓等[4]利用堿性介質(zhì)中, 鹽酸多巴胺對魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的強(qiáng)烈抑制作用, 建立了反相流動注射抑制化學(xué)發(fā)光測定鹽酸多巴胺的新方法。研究了影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的因素, 并探討了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的可能機(jī)理。該方法快速、準(zhǔn)確、線性范圍寬，可用于鹽酸多巴胺注射液中鹽酸多巴胺的測定。牛凌梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在硫酸環(huán)境下，高錳酸鉀氧化多巴胺能形成化學(xué)發(fā)光體系，該體系的發(fā)光強(qiáng)度與多巴胺的濃度在1.25～25.0 mg/L呈良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為1.00 mg/L，建立了硫酸環(huán)境中流動注射化學(xué)發(fā)光法測定多巴胺的新方法。該方法可用于針劑中多巴胺的測定。進(jìn)一步，該小組[6]又利用自制微透析探針收集透析液中多巴胺檢測的方法，建立了微透析法取樣，化學(xué)發(fā)光測定多巴胺的新方法。結(jié)果表明自制探針的回收率與透析膜長度呈正相關(guān)，與灌流速度呈反相關(guān)。外液中多巴胺的濃度在25.0～250 mg/L時，所測的發(fā)光強(qiáng)度與其濃度呈良好的線性關(guān)系。表明自制微透析探針性能穩(wěn)定，可進(jìn)行體液中多巴胺的檢測。馬新顏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性介質(zhì)中，高錳酸鉀氧化甲醛能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，當(dāng)該體系中存在多巴胺時，體系發(fā)光信號會顯著增強(qiáng)。基于這一現(xiàn)象，建立了測定多巴胺的流動注射化學(xué)發(fā)光新方法。并將該方法用于全血中多巴胺的測定。

3 化學(xué)熒光法

CdTe量子點由于其優(yōu)良的熒光分析特性而作為熒光試劑應(yīng)用在金屬離子和生物活性物質(zhì)的標(biāo)記和高靈敏分析中。陳志兵等[8]在溫和的條件下制備CdTe量子點，研究表明，該量子點的熒光強(qiáng)度可強(qiáng)烈地被鹽酸多巴胺增敏。據(jù)此發(fā)現(xiàn)并建立了以CdTe量子點作為熒光探針，基于熒光增敏測定有機(jī)藥物成分中鹽酸多巴胺含量的新方法。顏梅等[9]制備了以二硫基琥珀酰亞胺丙酸酯，4-巰基苯硼酸功能化CdTe量子點探針，在431 nm激發(fā)波長下，對探針及加入多巴胺后進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，在最大發(fā)射波長處，多巴胺對合成的探針具有猝滅效應(yīng)，且多巴胺對體系的猝滅程度與多巴胺的量呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了一種基于雙分子識別熒光猝滅法高選擇性測定多巴胺的新方法。在最佳條件下，多巴胺的線性范圍為0.02～20.0 mmol/L，檢出限為4.9 nmol/ L。該方法已成功用于多巴胺注射液、血清及尿樣中多巴胺的測定。陳亞紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性介質(zhì)中，鹽酸多巴胺對血紅蛋白酶催化熒光體系具有強(qiáng)烈的猝滅作用, 因此建立了酶催化熒光光譜法測定鹽酸多巴胺的新方法。該方法的檢出限為8.2 nmol/L。該法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好的特點，已成功地應(yīng)用于藥物制劑中鹽酸多巴胺含量的測定。

4 液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）也是通用的多巴胺檢測方法。高效液相色譜法因其具有極高的分離率，所以在兒茶酚胺類物質(zhì)的分析中受到極大重視。HPLC法同熒光檢測相結(jié)合是目前較為有效且常用的方法。兒茶酚胺類物質(zhì)本身有自然熒光，經(jīng)HPLC法分離后，可以利用它的熒光進(jìn)行檢測。吳予明等[11]利用HPLC和熒光檢測器對嗜鉻細(xì)胞瘤患者和正常人24 h尿中的去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺進(jìn)行了測定。結(jié)果可見，多巴胺濃度在130.6～3 858.2 nmol/L與色譜峰峰高的線性關(guān)系良好。測定結(jié)果顯示此法簡單、準(zhǔn)確、特異性高。通過對正常人及嗜鉻細(xì)胞瘤患者24 h尿樣分析，二者兒茶酚胺類物質(zhì)的含量有顯著性差異。表明該研究可以為臨床嗜鉻細(xì)胞瘤診斷提供數(shù)據(jù)。喬坤云等[12]采用與文獻(xiàn)[11]不同的色譜柱，不同的前處理方法，用高效液相色譜法，熒光檢測器檢測兒茶酚胺含量。實驗表明去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺三種組分的濃度與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系。該方法可在臨床推廣使用。

5 電化學(xué)方法

由于多巴胺分子內(nèi)含有2個容易被氧化的酚羥基，故具有電化學(xué)活性，因此可用電化學(xué)方法對其進(jìn)行定量檢測。然而，多巴胺在金電極、鉑電極或玻碳電極等裸電極上的過電位高，電極反應(yīng)緩慢，且其本身或反應(yīng)產(chǎn)物易吸附于電極表面，導(dǎo)致電極鈍化，靈敏度低。此外在一些生物樣品中, 共存物質(zhì)如腎上腺素( EP )、維生素C、尿酸（UA）其氧化峰電位與多巴胺相近, 所以對多巴胺的測定造成嚴(yán)重干擾。因此，如何選擇性地測定多巴胺成為多巴胺檢測的研究熱點和難點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)修飾電極能降低過電位并可增加多巴胺的傳質(zhì)速率，并能有效地利用電極的修飾表面對分析物選擇富集、滲透等功能進(jìn)行檢測。從而提高分析的選擇性和靈敏度。故使用化學(xué)修飾電極研究多巴胺的電化學(xué)行為引起了人們的廣泛關(guān)注。

牛凌梅等[13]用2,3-二巰基丁二酸修飾金電極，研究了腎上腺素和多巴胺在該修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)，表明由于該電極的催化作用，腎上腺素和多巴胺的電化學(xué)信號明顯增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素與多巴胺的氧化峰電位雖不可分離，但在該修飾金電極上，腎上腺素沒有還原峰，故還原峰電流只與多巴胺的濃度呈線性關(guān)系，而氧化峰電流卻恰好等于兩者單獨氧化的峰電流之和。因此，建立了一種同時測定多巴胺與腎上腺素含量的方法。陳德志等[14]利用循環(huán)伏安法電聚合研制了溴百里香酚藍(lán)聚合膜修飾電極，研究了多巴胺在該修飾電極上的伏安行為，建立了維生素C和尿酸同時存在時多巴膠定量檢測的電化學(xué)新方法，并將該法用于實際樣品鹽酸多巴胺注射液的含量檢測。孫瑤等[15]采用循環(huán)伏安法制備了預(yù)陽極化碳糊電極，研究了對乙酰氨基酚和多巴胺在該修飾電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，預(yù)陽極化碳糊電極對對乙酰氨基酚和多巴胺的電化學(xué)行為具有良好的電催化作用。對乙酰氨基酚和多巴胺的氧化峰電流與其濃度在2.0×10-6～5.0×10-4mol/L呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為6.3×10-7mol/L和2.5×10-7mol /L。該方法已用于藥物樣品中對乙酰氨基酚和多巴胺的測定。

6 其他方法

邢憲榮等[16]利用分子印跡技術(shù)，結(jié)合聚苯胺、多壁碳納米管和金納米粒子-絲素蛋白復(fù)合物構(gòu)建新型檢測多巴胺的分子印跡電化學(xué)傳感器。分子印跡聚合物以多巴胺為模板，正硅酸乙酯和苯基三乙氧基硅烷為功能單體合成。當(dāng)pH值為7.0，模板與單體的物質(zhì)的量比為1∶5 時，該傳感器的線性范圍為5.0×10-8～9×10-6mol /L，檢測限為1.02×10-8mol /L。

課題組[17-19]采用電化學(xué)腐蝕/沉積方法制備溶液中穩(wěn)定的貴金屬Au量子線，因為金屬量子線的電導(dǎo)僅被導(dǎo)線最細(xì)部分的少數(shù)幾個原子所決定，因此在表面吸附少數(shù)幾個分子必然會帶來量子線電導(dǎo)的改變。而多巴胺分子中含有一個自由的氨基，能與Au形成配位鍵，因而多巴胺分子的吸附必然會帶來Au量子線電導(dǎo)的改變。研究表明，該方法可以高靈敏度檢測多巴胺，理論上可以達(dá)到分子水平。而且不會受到維生素C和二羥基苯丙酸的干擾，因為兩者分子中不含有與金成鍵的基團(tuán)。目前該方法適用于檢測簡單體系中的多巴胺，如藥劑檢測。對于復(fù)雜體系中的檢測則存在缺陷，因此需要結(jié)合其他手段提高其選擇性，這是課題組目前工作的方向。

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（責(zé)任編輯：劉俊華）

Study on detection method for cerebral neurotransmitter dopamine

ZHANG Qingyun, LI Jialin, ZHENG Pei, LI Yanxia, CHE Yuxuan, DONG Xiaodong
(College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000,China)

Dopamine is a special neurotransmitter in human brain, and the abnormal changes of its content will result in the emergence of clinic illness, such as Parkinson's disease. How to detect the dopamine simply and quickly is an important topic concerned by the researchers all over the world. The usual detection methods include spectrophotometry, chemiluminescence method, chemical fluorescence method, liquid chromatography, electrochemical method, et al. In this article the studies of detection methods for dopamine in recent years are reviewed.

dopamine; neurotransmitter; Parkinson's disease; detection

O65

A

1674-490X(2014)01-0087-04

2013-12-24

河北省自然科學(xué)基金項目（B2011201101）；河北大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金項目（BM201108）；河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科專項基金項目（2012A1003）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310075018）；河北大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（2012085）

張慶云（1992—），女，河北邢臺人。

董曉東（1976—），男，吉林洮南人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事電化學(xué)生物傳感器研究。E-mail: xddong@hbu.edu.cn