MicroRNA在HPV相關(guān)宮頸癌中的研究進(jìn)展

張祖雯(綜述),趙菊梅(審校)

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安716000)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度及發(fā)病率僅次于乳腺癌排第2位，病死率居第5位，是威脅女性健康、導(dǎo)致婦女死亡的主要惡性腫瘤之一[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%[3]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，它是由正常宮頸上皮細(xì)胞從增生到化生、從化生再到不典型增生、最后癌變的一個由多基因、多階段異常調(diào)控的過程。大量研究已經(jīng)證實(shí)[4-6]，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是宮頸癌發(fā)生的必要條件，但單純的HPV感染并不能直接導(dǎo)致宮頸癌。近年來眾多研究者在對HPV感染和致癌過程中微RNA(microRNA，miRNA)的表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了一定的研究，發(fā)現(xiàn)某些miRNA與HPV有協(xié)同或拮抗作用。這為研究宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展提供了理論依據(jù)，為宮頸癌的基因診斷、治療提供了新的方向。

1 miRNA的概述

1.1miRNA的概念與發(fā)現(xiàn) miRNA是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)的高度保守的小分子非編碼核糖核酸，是一類長度為18～24個核苷酸(nt)的單鏈RNA 分子片段[7]。首次被發(fā)現(xiàn)的miRNA是miRNA lin-4,是在1993年由Lee等[8]在對秀麗隱桿線蟲(caenorhabditis elegan)進(jìn)行遺傳學(xué)分析時首次發(fā)現(xiàn)并報道的。隨后在2000年的《Nature》雜志和2001年的《Science》雜志上相繼對miRNA的研究進(jìn)行了報道，2002年12月19日《Science》雜志將miRNA評為2002年世界十大科技突破之一，引起了世界眾多學(xué)者的關(guān)注，隨后miRNA的研究得到了空前的發(fā)展，據(jù)miRBase(http://www.mirbase.org/)的最新數(shù)據(jù)顯示，已有24 521種miRNA(miRBase Release 20 B2013.6)被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于多個物種體內(nèi)，如動物、植物、寄生蟲、DNA病毒等。人源性的miRNA已被證實(shí)的已有1872種(miRBase Release 20 B2013.6)[9-12]。

1.2miRNA的作用機(jī)制 miRNA的主要作用是調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體生理、病理功能，如機(jī)體的生長發(fā)育、細(xì)胞的凋亡以及疾病與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等。miRNA的主要調(diào)控機(jī)制是成熟miRNA的5′端第2～8個核苷酸序列與靶mRNA的3′端非編碼區(qū)相互識別配對[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，超過60%的人類編碼基因可與miRNA進(jìn)行選擇性配對[14]，且根據(jù)序列互補(bǔ)的程度,完全互補(bǔ)miRNA可導(dǎo)致靶mRNA的降解，不完全互補(bǔ)抑制靶mRNA 的翻譯[15]。除了上述作用外，在Vasudevan等[16]的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA在有些哺乳動物細(xì)胞中可以使目標(biāo)基因的表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。

2 miRNA與宮頸癌

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已證實(shí)miRNA在癌組織及血清中的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥有密切關(guān)系。Yao等[17]的研究發(fā)現(xiàn),miR-21有明顯的促瘤生長作用,而且驗(yàn)證程序性細(xì)胞死亡因子4的3′非翻譯區(qū)(PDCD4-3′UTR)18 bp靶位是miR-21的唯一的調(diào)控位點(diǎn)。Hu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a和miR-9對宮頸癌患者的預(yù)后有重要意義，其中miR-200可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和抑制基因的表達(dá)來影響宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而miR-9則通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的新陳代謝在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮潛在的作用。Lee等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a可能是宮頸癌基因治療的一個潛在靶點(diǎn)，他們利用anti-miR-199a及與順鉑聯(lián)合的anti-miR-199a轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)兩組培養(yǎng)細(xì)胞均受到抑制，且聯(lián)合組抑制作用更明顯，還存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系。雖然對于miRNA在宮頸癌中的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后都有研究，但是miRNA在宮頸癌中具體的作用機(jī)制尚未明確，還需要繼續(xù)探索、研究[20]。

3 miRNA在HPV相關(guān)宮頸癌中的研究現(xiàn)狀

盡管已經(jīng)證實(shí)HPV與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，但有研究證實(shí)單純的HPV感染并不能直接導(dǎo)致宮頸癌。近年來，隨著對miRNA在宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到miRNA與HPV的聯(lián)系上。有研究發(fā)現(xiàn)，在HPV整合位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)約有53個miRNA基因，且出現(xiàn)的頻率高達(dá)73%，而檢測出的miRNA約有39個曾研究與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[21]。因此，在HPV(+)的宮頸癌患者中miRNA的異常表達(dá)可能與HPV的感染有著密切的聯(lián)系。下面就近幾年在研究HPV相關(guān)宮頸癌患者中miRNA的表達(dá)特征及其調(diào)控機(jī)制等方面的文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)。

3.1miRNA與HPV相關(guān)宮頸癌表達(dá)譜的研究 李陽[22]利用生物芯片技術(shù)和高通量技術(shù)等通過miRNA組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和HPV的宏基因組學(xué)水平研究篩選了可以用于HPV感染和宮頸病變發(fā)生過程中早期診斷、預(yù)測和靶向治療的miRNA標(biāo)志物，對比分析了6例HPV(-)正常宮頸組織、7例單純HPV16(+)正常宮頸組織、6例單純HPV16(+)宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical interaepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ～Ⅲ期的宮頸組織和6例單純HPV16(+)宮頸癌組織中的不同miRNA表達(dá)特征,并通過芯片差異顯著性分析和深度分析,篩選宮頸癌發(fā)生過程中差異表達(dá)的miRNA,并通過實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)驗(yàn)證miRNA芯片數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在這4組研究數(shù)據(jù)中有52個miRNA的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中31個miRNA在HPV(-)正常宮頸組織、HPV16(+)CINⅡ～Ⅲ、HPV16(+)宮頸癌組織3組中有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在該研究中識別了不同HPV感染狀態(tài)的宮頸組織miRNA表達(dá)譜,31個miRNA可能與HPV(+)的宮頸癌發(fā)生相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變的進(jìn)展,miR-375,miR-29a,miR-99a,miR-195的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，miR-92a,miR-155的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，說明這些miRNA與HPV(+)宮頸癌的發(fā)展有密切關(guān)系。利用miRNA靶體數(shù)據(jù)庫和基因GENE數(shù)據(jù)庫,篩選了與HPV感染相關(guān)的miRNA靶基因,構(gòu)建了“HPV感染相關(guān)miRNA/靶體基因網(wǎng)絡(luò)圖，并且發(fā)現(xiàn)miR-29可能是與HPV致癌過程關(guān)系最為密切的miRNA。Rao等[23]利用miRNA基因芯片(microarray chips with 924 probes)技術(shù)比較分析了感染HPV16和(或)HPV18的13例宮頸癌患者(11例宮頸鱗癌,1例宮頸腺癌,1例子宮頸肉瘤)的宮頸癌組織及相鄰正常宮頸組織中miRNA的表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中有18種miRNA明顯上調(diào)，19種miRNA明顯下調(diào)。此研究結(jié)果顯示，HPV(+)的宮頸癌組織的miRNA的表達(dá)與鄰近的正常宮頸組織的miRNA表達(dá)有差異。由此推斷，miRNA的異常表達(dá)與HPV相關(guān)性宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是有密切關(guān)系的。

3.2miRNA在HPV相關(guān)宮頸癌中的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及潛在臨床意義的研究

3.2.1miRNA-218 Martinez等[20]利用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和RNA印跡技術(shù)比較分析了HPV16(+)宮頸癌細(xì)胞株和HPV(-)宮頸癌細(xì)胞株中miRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)miR-218在HPV(+)宮頸癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)miR-218的作用靶點(diǎn)就是特異性上皮細(xì)胞標(biāo)志物層粘連蛋白3的基因，而且發(fā)現(xiàn)HPV16(+)宮頸癌細(xì)胞中原癌基因E6能夠抑制miR-218的表達(dá)，并且利用RNA干擾技術(shù)抑制原癌基因E6/E7后miR218的表達(dá)卻上調(diào)。為了更進(jìn)一步地了解miR-218與HPV感染性宮頸癌的相關(guān)性，Gao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染者miR-218表達(dá)水平顯著低于HPV低危、中危及HPV(-)感染者的miR-218表達(dá)水平，而且高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者miR-218的表達(dá)水平顯著低于低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變者。因此推斷，高危型HPV感染可以下調(diào)miR-218表達(dá)，并且miR-218低表達(dá)可能與HPV(+)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

3.2.2miR-29 李陽[22]利用高通量技術(shù)對HPV相關(guān)全基因組分析時發(fā)現(xiàn)，miR-29可能是與HPV致癌過程關(guān)系最為密切的miRNA，miRNA可能通過細(xì)胞周期等生物學(xué)功能參與HPV相關(guān)的宮頸癌發(fā)生過程。李陽[22]又通過體內(nèi)宮頸組織標(biāo)本相關(guān)性分析和體外功能學(xué)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-29通過靶向作用陰陽因子1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6來調(diào)控細(xì)胞的周期和凋亡,促進(jìn)HPV誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程,從而參與宮頸癌的發(fā)生。

3.2.3miR-34 在Wang等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，HPV能通過HPV16(+)和HPV18(+)的E6癌基因直接和間接地影響miR-34，使其表達(dá)下調(diào)。另有研究結(jié)果顯示，HPV病毒感染的早期蛋白E6可能通過導(dǎo)致miR-34a的低表達(dá)來阻斷抑癌基因p53的表達(dá)，從而對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生作用[26]。

3.2.4miR-16 近期，林茂等[27]研究設(shè)計了三條Dicer基因的小干擾RNA(small interfering，siRNA)，對HPV18陽性的HeLa229細(xì)胞實(shí)施干預(yù)，在不同濃度(40、60及80 nmol/L)、不同時間(24、48及72 h)的條件下干預(yù)后通過定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，40 nmol/L的Dicer siRNA干預(yù)可顯著下調(diào)HPV18 E6、E7及miR-16基因表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)HPV18 E6、E7基因編碼區(qū)存在miR-16的結(jié)合位點(diǎn)。因此,推斷Dicer siRNA干預(yù)能顯著下調(diào)高危型HPV18E6、E7基因的表達(dá)，miR-16可能參與HPV18E6、E7基因表達(dá)調(diào)控。

3.2.5miRNA-145 在Gunasekharan等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-145在 HPV(+)細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)降低了HPV基因的擴(kuò)增及后期表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)miRNA-145的目標(biāo)序列在HPV 31 E1和E2基因的開放閱讀區(qū)，研究結(jié)果顯示，HPV可以調(diào)節(jié)miR-145的表達(dá)來控制自己的生命周期。

3.2.6miR-99b 在吳維光[29]的研究中發(fā)現(xiàn)，HPV(+)宮頸腺癌組織共有15條miRNA基因表達(dá)發(fā)生變化，其中上調(diào)表達(dá)的11個，下調(diào)表達(dá)的4個,而且發(fā)現(xiàn)miR-99b表達(dá)上調(diào)的HeLa細(xì)胞生殖率降低、凋亡率增加，HeLa細(xì)胞的移植瘤生長減慢，移植瘤微血管形成減少；在miR-99b表達(dá)上調(diào)的HeLa細(xì)胞中共有69個基因表達(dá)發(fā)生變化，其中上調(diào)表達(dá)的有43條，下調(diào)表達(dá)的有26條。因此得出結(jié)論:HPV(+)的宮頸腺癌組織中表達(dá)下調(diào)的miR-99b參與了HPV誘導(dǎo)宮頸腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。

3.2.7其他 在Gu等[30]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-466、miR-467和miR-669是常見且特定于黏膜HPV(HPV6、HPV11、HPV16和HPV18)的類型，并且應(yīng)用Northern印跡雜交技術(shù)證實(shí)了這幾種miRNA是由HPV(+)宮頸癌細(xì)胞系中的人類黏膜乳頭瘤病毒(mucosal HPV)編碼的。

4 小 結(jié)

miRNA的發(fā)現(xiàn)是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重大突破，為人們了解基因和基因的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制方面提供了新的視角，更使人們對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有了新的認(rèn)識。HPV雖然已經(jīng)是宮頸癌發(fā)生的確定因素，但其導(dǎo)致宮頸癌的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，把HPV和miRNA聯(lián)系起來研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。目前對HPV和miRNA在宮頸癌中相互關(guān)系的研究還處在起步階段，對于HPV和miRNA之間的聯(lián)系和在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制還不是很明確，但是許多研究提示HPV和miRNA之間可能存在著某種協(xié)同或者拮抗作用，明確兩者間的關(guān)系能為研究者在宮頸癌的病因?qū)W、分子病理學(xué)和基因診斷及治療方面的研究提供新的思路。

[1] Ili CG,Brebi P,López J,etal.Genotyping of human papillomavirus in cervical intraepithelial neoplasia in a highrisk population[J].J Med Virol,2011,83(5):833-837.

[2] Nam EJ,Kim JW,Kim SW,etal.The expressions of the Rb pathway in cervical intraepithelial neoplasia; predictive and prognostic significance[J].Gynecol Oncol,2007,104(1):27-211.

[3] Valdespino VM,Valdespino VE.Cervical cancer screening:state of the art[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2006,18(1):35-40.

[4] Cai HB,Ding XH,Chen CC.Prevalence of single and multiple human papillomavirus types in cervical cancer and precursor lesions in Hubei，China[J].Oncology,2009,76(3):157-161.

[5] Wentzensen N,Wilson LE,Wheeler CM,etal.Hierarchical clustering of human papilloma virus genotype patterns in the ASCUSLSIL triage study[J].Cancer Res,2010,70(21):8578-8586.

[6] Giorgi Rossi P,Chini F,Bisanzi B,etal.Distribution of high and low risk HPV types by cytological status:a population based study from Italy[J].Infect Agent Cancer,2011,6:2.

[7] Kuhlmann JD,Rasch J,Wimberger P,etal.microRNA and the pathogenesis of ovarian cancer—a new horizon for molecular diagnostics and treatment[J].Clin Chem Lab Med,2012,50(4):601-615.

[8] Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heteroch ronic gene lin-4 encodes small RNA with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[9] Hammond SM,Bernstein E,Beach D,etal.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404(6775):293-296.

[10] Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,etal.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[11] Lee RC,Ambros V.An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans[J].Science,2001,294(5543):862-864.

[12] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,etal.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science,2001,294(5543):853-858.

[13] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[14] Friedman RC,Farh KK,Burge CB,etal.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J].Genome Res,2009,19(1):92-105.

[15] Eulalio A,Huntzinger E,Nishihara T,etal.Deadenylation is a widespread effect of miRNA regulation[J].RNA,2009,15(1):21-32.

[16] Vasudevan S,Tong Y,Steitz JA.Switching from repression to activation:microRNAs can up-regulate translation[J].Science,2007,318(5858):1931-1934.

[17] Yao Q,Xu H,Zhang QQ,etal.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4(PDCD4)in HeLa cervical carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539-542.

[18] Hu X,Schwarz JK,Lewis JS Jr,etal.A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis[J].Cancer Res,2010,70(4):1441-1448.

[19] Lee JW,Choi CH,Choi JJ,etal.Altered microRNA expression in cervical carcinomas[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2535-2542.

[20] Martinez I,Gardiner AS,Board KF,etal.Human papillomavirus type 16 reduces the expression of microRNA-218 in cervical carcinoma cells[J].Oncogene,2008,27(18):2575-2582.

[21] Nambaru L,Meenakumari B,Swaminathan R,etal.Prognostic significance of HPV physical status and integration sites in cervical cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2009,10(3):355-360.

[22] 李陽.基于高通量技術(shù)的HPV相關(guān)全基因組分析及特定miRNA在宮頸癌發(fā)生中的作用與機(jī)制[D].杭州：浙江大學(xué)，2012.

[23] Rao Q,Shen Q,Zhou H,etal.Aberrant microRNA expression in human cervical carcinomas[J].Med Oncol,2012,29(2):1242-1248.

[24] Gao C,Zhang Z,Liu W,etal.Reduced microRNA-218 expression is associated with high nuclear factor kappa B activation in gastric cancer[J].Cancer,2010,116(1):41-49.

[25] Wang X,Wang HK,McCoy JP,etal.Oncogenic HPV infection interrupts the expression of tumor-suppressive miR-34a through viral oncoprotein E6[J].RNA,2009,15(4):637-647.

[26] Li B,Hu Y,Ye F,etal.Reduced miR-34a expression in normal cervical tissues and cervical lesions with high-risk human papillomavirus infection[J].Int J Gynecol Cancer,2010,20(4):597-604.

[27] 林茂，盧徐漣，胡飛紅,等.Dicer干預(yù)對HPV18 E6/E7 基因表達(dá)的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，43(2)：101-105.

[28] Gunasekharan V,Laimins LA.Human papillomaviruses modulate microRNA 145 expression to directly control genome amplification[J].J Virol,2013,87(10):6037-6043.

[29] 吳維光.HPV陽性宮頸腺癌相關(guān)miRNAs篩選和功能分析[D].廣州：中山大學(xué)，2008.

[30] Gu W,An J,Ye P,etal.Prediction of conserved microRNAs from skin and mucosal human papillomaviruses[J].Arch Virology,2011,156(7):1161-1171.