泛素化調(diào)控與中藥抗炎

俞雯雯(綜述)，史麗云(審校)

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053； 2.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,杭州 310036)

炎癥性疾病與代謝性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病甚至腫瘤等重要疾病密切相關(guān)。中藥資源豐富，來(lái)源廣泛，利用中藥進(jìn)行抗炎治療在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用。例如,板藍(lán)根可以用于治療急性扁桃體炎、咽喉炎[1]；魚腥草、金銀花可以用于治療肺炎[2-3]；馬齒莧水煎液可用于治療急性腸炎[4]；黃連主治急性結(jié)膜炎[5]；蒲公英可用于治療急性扁桃體炎等[6]。此外，中草藥也可用于治療慢性疾病，如慢性肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等[7-9]。一些中藥活性成分如苷類、生物堿類、黃酮類、萜類、揮發(fā)油等都具有很好的抗炎作用，對(duì)這些成分的抗炎機(jī)制的研究給人們認(rèn)識(shí)中藥提供了新的思路。蛋白質(zhì)泛素化修飾是一種可逆的共價(jià)修飾過(guò)程，能夠調(diào)節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)等，是人體眾多生理和病理反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。泛素化修飾也是炎癥信號(hào)途徑中一種重要的調(diào)控方式。有研究顯示，以泛素化修飾為主要作用靶位的炎癥信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制已成為中藥抑炎的一種新的作用模式[10]。

1 泛素與泛素化調(diào)控

泛素是一種相對(duì)分子質(zhì)量為8.6×103的小分子蛋白，包含76個(gè)氨基酸，在真核生物中具有高度保守性。泛素本身含有7個(gè)賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過(guò)這些位點(diǎn)互相連接，形成多泛素蛋白鏈。泛素和其他類泛素蛋白一樣，具有特異的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[11]。蛋白質(zhì)的泛素化由三種酶催化進(jìn)行，分別是泛素活化酶(ubiquitin-activating enzymes,E1)、泛素綴合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)及泛素-蛋白質(zhì)連接酶(ubiquitin ligases,E3)[12]。首先，E1將腺苷三磷酸水解成腺苷一磷酸，并將一個(gè)泛素分子腺苷酸化；隨后泛素被轉(zhuǎn)移到E1活性中心的半胱氨酸殘基上，并伴隨著第二個(gè)泛素分子的腺苷酸化；被腺苷酸化的泛素分子隨之被轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸殘基上。在此基礎(chǔ)上，E3通過(guò)選擇性識(shí)別底物與E2催化泛素從E2轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，并通過(guò)異肽鍵與之相連。泛素可以單體形式與靶蛋白連接，也可通過(guò)E1、E2、E3的重復(fù)循環(huán)，促進(jìn)了泛素與其他泛素的連接以形成多聚泛素鏈[12-13]。以單體或以多聚泛素鏈形式取決于蛋白分子內(nèi)部的賴氨酸殘基或N端甲硫氨酸的類型。多聚泛素鏈的連接位點(diǎn)能夠影響底物的命運(yùn)，如果多泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第48位賴氨酸殘基相連，可介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)入蛋白酶體而被降解；如果與被修飾蛋白上其他位點(diǎn)，如第63位賴氨酸殘基相連，則靶蛋白不被降解而發(fā)揮信號(hào)途徑功能，如調(diào)控DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)重構(gòu)、囊泡運(yùn)輸及蛋白激酶激活等[14]。泛素化修飾途徑是一可逆過(guò)程，即可以通過(guò)去泛素化酶將泛素蛋白修飾物除去，這種可逆的修飾途徑非常適合作為維持眾多生命活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制。

如同眾多蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，如磷酸化、甲基化、乙?；?、羥基化、糖基化等，泛素化調(diào)控了許多重要的細(xì)胞功能，特別是一些關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，包括蛋白酶體的降解、DNA的損傷修復(fù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)同樣受到泛素化機(jī)制的調(diào)控[13,15]。

2 泛素化調(diào)控與炎癥通路

炎性反應(yīng)是機(jī)體針對(duì)感染因子或有害物質(zhì)等產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。正常狀態(tài)下的炎癥應(yīng)答可以通過(guò)動(dòng)員一系列炎性細(xì)胞和效應(yīng)分子等，有效清除有害因子，恢復(fù)機(jī)體生理平衡。而過(guò)度的炎性反應(yīng)造成組織損傷、功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)各類炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、退行性疾病、腫瘤等。因此，炎癥的發(fā)生、發(fā)展和平息等過(guò)程受到一系列因子的嚴(yán)密調(diào)控。作為生物體內(nèi)非常重要的一種調(diào)控手段—泛素化修飾途徑，毫無(wú)疑問(wèn)也在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到了重要作用。

炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)起始于機(jī)體免疫細(xì)胞或其他組織細(xì)胞對(duì)病原相關(guān)分子或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式的識(shí)別或活化，并通過(guò)一系列接頭分子參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起轉(zhuǎn)錄因子的活化和炎性效應(yīng)分子的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子,如核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、活化蛋白1、干擾素調(diào)節(jié)因子等決定著炎性細(xì)胞因子、趨化因子和其他效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在已知的轉(zhuǎn)錄因子中，NF-κB是參與炎癥基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵分子[16-17]。

NF-κB信號(hào)途徑廣泛存在，但是在大部分細(xì)胞中它都處于失活狀態(tài)；在包括來(lái)自微生物等的各種刺激因子的作用之下，細(xì)胞通過(guò)Toll樣受體、NOD樣受體、RIG-I樣受體等介導(dǎo)的途徑而被活化。在這個(gè)過(guò)程中，泛素化修飾扮演著重要的角色。以Toll樣受體4介導(dǎo)的信號(hào)途徑為例，位于細(xì)胞膜或內(nèi)體的Toll樣受體4分子通過(guò)感受病原相關(guān)分子而活化，并通過(guò)Toll-白細(xì)胞介素1受體結(jié)構(gòu)域，與髓樣分化初始應(yīng)答基因88蛋白發(fā)生相互作用。隨即，髓樣分化初始應(yīng)答基因88蛋白招募和活化白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶家族蛋白，促進(jìn)腫瘤壞死相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)蛋白的寡聚化。TRAF6蛋白本身即是一種E3，它與E2一起催化第63位賴氨酸位點(diǎn)的泛素化，并形成多泛素蛋白聚合體。這種多泛素蛋白進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β相關(guān)激酶1蛋白，由此引起IκB蛋白的磷酸化和活化。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β相關(guān)激酶1蛋白也能通過(guò)磷酸有絲分裂原激活蛋白激酶而激活c-Jun N端激酶和p38激酶信號(hào)途徑。IκB激酶的活化是引起后續(xù)IκB蛋白磷酸化和NF-κB活化的關(guān)鍵步驟，在這一階段中泛素化又起著決定性的作用[18-20]。

NF-κB信號(hào)在大部分細(xì)胞中處于失活狀態(tài)，主要是因?yàn)镹F-κB亞基分子被IκB結(jié)合而被“禁錮”于細(xì)胞質(zhì)中。上述Toll樣受體介導(dǎo)的IκB的活化可導(dǎo)致IκB蛋白快速發(fā)生磷酸化修飾，從而招募含有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白β-TrCP、SKP1等蛋白，與E3形成復(fù)合體。該復(fù)合體與E2共同作用，導(dǎo)致已被磷酸化的IκB蛋白發(fā)生多泛素化修飾。這種被泛素化修飾后的IκB蛋白雖仍與NF-κB蛋白結(jié)合在一起，但是很快就會(huì)被26S蛋白酶體降解，從而“釋放”出NF-κB蛋白，進(jìn)而引起NF-κB入核和炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[21-22]。

由此可見，泛素化修飾決定了NF-κB的活化過(guò)程；與之相反，為了保證在更為精細(xì)水平上對(duì)NF-κB途徑實(shí)行調(diào)控，去泛素化酶可通過(guò)去除泛素蛋白修飾物來(lái)發(fā)揮炎癥抑制作用[23]。目前已知的去泛素化酶蛋白有90多種，其中包括Cylindromatosis、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白3等重要的炎癥調(diào)控分子。Cylindromatosis蛋白含有3個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、甘氨酸結(jié)構(gòu)域和1個(gè)泛素蛋白特異性蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。因此，Cylindromatosis蛋白能高度特異性地水解63位賴氨酸連接的多泛素蛋白復(fù)合體，從而阻止轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β相關(guān)激酶1蛋白、c-Jun N端激酶蛋白和IκB蛋白的活化。與此相一致，Cylindromatosis突變小鼠表現(xiàn)出了與IκB過(guò)度激活有關(guān)的炎性反應(yīng)特征[24-25]。A20蛋白是另一類通過(guò)泛素修飾途徑來(lái)抑制NF-κB信號(hào)途徑的調(diào)控分子。研究顯示，A20可通過(guò)其去泛素化作用中止K63多聚泛素鏈或通過(guò)阻斷TRAF6與E2的相互作用，來(lái)抑制TRAF6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]；此外，A20還可催化TRAF6的K48泛素化，使其降解，導(dǎo)致信號(hào)鏈的完全終止[27]。因此，A20基因剔除小鼠表現(xiàn)為針對(duì)脂多糖的敏感性異常增高，機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的多器官炎癥[28-31]。

3 泛素化調(diào)控與中藥抗炎

近年來(lái)，隨著人們對(duì)炎癥本質(zhì)和其分子機(jī)制研究的深入，有關(guān)中醫(yī)抗炎機(jī)制的研究也逐漸從單純的現(xiàn)象觀察和描述深入到分子和細(xì)胞水平。針對(duì)臨床療效突出的一些中藥抗炎機(jī)制的研究表明，某些藥物分子不但在轉(zhuǎn)錄水平上參與炎癥信號(hào)分子的表達(dá)調(diào)控，而且也參與蛋白水平上的表達(dá)調(diào)控。對(duì)關(guān)鍵信號(hào)分子的泛素化修飾調(diào)控已成為中藥抗炎的一種新機(jī)制。

紫花前胡苷是從朝鮮當(dāng)歸根部分離出來(lái)的一種香豆素類化合物，具有神經(jīng)保護(hù)、抗菌和記憶增強(qiáng)等功效。Rim等[32]發(fā)現(xiàn),紫花前胡苷在體內(nèi)外具有抗炎作用，可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎性因子，如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶的表達(dá)，并對(duì)小鼠致死性內(nèi)毒素休克起到一定的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究顯示紫花前胡苷能抑制IκBα/β激酶的磷酸化，降低IκBα的降解速率。而與此相關(guān)聯(lián)的上游事件是由于紫花前胡苷可引起TRAF6泛素化水平的顯著降低，并顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶TANK結(jié)合激酶1與TRAF6的結(jié)合，進(jìn)而抑制下游炎性途徑的活化。同樣，中藥單體澤蘭內(nèi)酯亦是通過(guò)抑制TRAF6的泛素化以及蛋白酶體依賴的降解途徑，來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及活化蛋白1介導(dǎo)的炎性基因的表達(dá)。澤蘭內(nèi)酯是從旋復(fù)花中提取而得到的倍半萜內(nèi)酯，常被用于治療支氣管炎等炎性疾病，對(duì)其分子機(jī)制的研究為該藥物的臨床應(yīng)用提供了充分的理論依據(jù)[33]。

雷公藤甲素是從中草藥雷公藤的根﹑葉﹑花及果實(shí)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎及免疫抑制活性。盡管對(duì)其作用機(jī)制尚未完全搞清，但研究顯示與其對(duì)NF-κB信號(hào)途徑的調(diào)控作用密切相關(guān)。Park等[34]發(fā)現(xiàn),納摩爾級(jí)的雷公藤甲素可以抑制組成性和誘導(dǎo)性的NF-κB激活，但是這種抑制作用不是通過(guò)直接抑制p65與DNA的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究表明，雷公藤甲素阻斷了腫瘤壞死因子誘導(dǎo)IκBα的泛素化和磷酸化過(guò)程，抑制了其活化后的降解過(guò)程，最終使p65與乙酰化酶CBP/p300的結(jié)合能力下降，阻礙了腫瘤壞死因子引起的炎性因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和炎癥應(yīng)答的發(fā)生。

另一種以NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)途徑為主要調(diào)控靶點(diǎn)的藥物是硫秋水仙苷，一種提取自植物嘉蘭的秋水仙堿苷，并經(jīng)半合成而得。該藥物是一種肌肉松弛劑，具有止痛抗炎作用，常被用于治療風(fēng)濕病和骨科疾病。研究證實(shí),硫秋水仙苷可有效抑制IκBα的泛素化，以及由此引發(fā)的蛋白酶體介導(dǎo)的降解作用，從而抑制NF-κB信號(hào)途徑[35]。由于NF-κB在炎癥和腫瘤發(fā)生過(guò)程中的重要作用，硫秋水仙苷不但顯示出其顯著的抗炎活性，而且可通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡基因表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

值得注意的是，有些中藥，如鐵線蕨乙醇提取物可以阻斷腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的NF-κB激活，但是它對(duì)NF-κB激活中所需的泛素化過(guò)程卻沒(méi)有任何影響，表明不同的中藥分子在調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥途徑中具有特異性的作用靶位[36]。

炎性反應(yīng)是一種多因子參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，并受到多種調(diào)控途徑的影響。在不同生理和病理機(jī)制下，炎性因子的表達(dá)特征、表達(dá)水平不但取決于轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而且也受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的影響。姜黃素是一種具有抗炎活性的天然多酚粗提液化合物，先前研究表明姜黃素能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而最近的研究顯示，姜黃素還能促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶的泛素化修飾，引發(fā)蛋白酶體依賴的降解過(guò)程，進(jìn)而快速清除體內(nèi)炎性因子。這種在轉(zhuǎn)錄后水平直接調(diào)控炎性因子穩(wěn)定性的方式為炎癥調(diào)控研究提供了新的思路[37]。

在一些炎癥相關(guān)疾病的治療過(guò)程中，以泛素化修飾為靶標(biāo)的中藥療法也顯示了其潛力。心肌癥是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的主要致死原因，其典型病變是心肌肥大及纖維化，而其中具為關(guān)鍵致病作用的蛋白分子是促肥厚蛋白p300。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，口服白藜蘆醇可以顯著抑制病變癥狀，恢復(fù)肌營(yíng)養(yǎng)不良大鼠的心臟舒張功能。機(jī)制研究顯示，白藜蘆醇可以激活尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙酰酶蛋白1，并通過(guò)脫乙酰酶蛋白1的作用引起關(guān)鍵蛋白p300脫乙酰和泛素化修飾。這種泛素化修飾可引起蛋白酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程，由此有效地抑制了致病因子p300的累積[38]。

4 展 望

中藥抗炎作用機(jī)制的研究已突破以往中藥藥理研究的低水平重復(fù)現(xiàn)象，研究人員不僅從炎癥的不同環(huán)節(jié)及途徑對(duì)其抗炎作用機(jī)制進(jìn)行研究，而且開始從分子、基因水平探討中藥的作用機(jī)制。但是，目前有關(guān)中藥的抗炎機(jī)制仍然了解不多，尤其對(duì)其分子信號(hào)途徑的認(rèn)識(shí)還不夠透徹。由于中藥是天然藥物，一味藥包含多種成分，它們具有相同或相異的抗炎作用機(jī)制，而且這些不同的抗炎作用是否起協(xié)同作用，是如何起協(xié)同作用等并不十分清楚，中藥的多組分決定了其抗炎作用的復(fù)雜性。結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、代謝學(xué)、免疫學(xué)等研究領(lǐng)域的前沿理論和技術(shù)，從現(xiàn)代分子-細(xì)胞-整體的角度來(lái)解析中藥抗炎的新機(jī)制，將會(huì)給古老的中醫(yī)臨床治療帶來(lái)新的生機(jī)。

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