HMGB1基因多態(tài)性與HBV相關(guān)性肝癌的關(guān)聯(lián)性研究*

王丹鄧春青趙龍鳳

HMGB1基因多態(tài)性與HBV相關(guān)性肝癌的關(guān)聯(lián)性研究*

王丹①鄧春青①趙龍鳳①

目的：探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）第4內(nèi)含子1176G/C與HBV感染后肝癌是否存在關(guān)聯(lián)。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）方法檢測110例HBV感染后肝癌患者及316例HBV感染后非肝癌患者HMGB1 1176G/C多態(tài)性，采用 χ2檢驗(yàn)及非條件logistic回歸統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。結(jié)果：乙肝肝癌組3種基因型及G、C等位基因分布與慢性乙型肝炎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.152，P=0.046；χ2=5.605，P=0.018）。在顯性模式下乙肝肝癌組與慢性乙型肝炎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），在隱性模式下與乙肝病毒攜帶組、輕型肝病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048，P=0.028），在共顯性模式下與輕型肝病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）。結(jié)論：HMGB1基因多態(tài)性與HBV感染后肝癌易感性相關(guān)。

高遷移率族蛋白B1； 單核苷酸； 乙型肝炎病毒； 多態(tài)性； 肝癌細(xì)胞

原發(fā)性肝癌（HCC，簡稱肝癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一，尤以東南沿海地區(qū)多見，自20世紀(jì)90年代以來已上升為惡性腫瘤的第2位，全國每年13萬人死于肝癌，其中約有1/3的患者有乙肝病史[1-2]。HBV感染遺傳易感性的相關(guān)基因已被不斷發(fā)現(xiàn)[3-5]。在HCC發(fā)病的相關(guān)因素中，遺傳易感性同樣起著重要作用，與之有關(guān)的基因多態(tài)性指標(biāo)有：GST、VDR、IL28B、HLA、STAT4、CXCL14等[6-11]。深入研究HBV及HCC遺傳易感性的分子機(jī)制對降低HCC的發(fā)病率及死亡率水平均具有重要意義。HMGB1是一類非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，具有誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)免疫等多種功能。大量實(shí)驗(yàn)證明，HMGB1參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程[12-13]。HMGB1基因多態(tài)性與多種疾病的遺傳易感性相關(guān)，但與HBV感染背景下HCC的發(fā)生是否有關(guān)聯(lián)，目前報(bào)道甚少[14-19]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 426例HBV感染者均為本院門診及住院患者，男334例，女92例，年齡（42.15±11.87）歲，均為漢族，且無親緣關(guān)系。所有病例診斷符合2005年中華醫(yī)學(xué)會肝病與感染病學(xué)分會修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除HIV、TP及其他肝炎病毒感染。樣本收集均獲患者知情同意。按疫病類型將患者分為四組，其中乙肝病毒攜帶組98例，男62例，女36例；慢性乙型肝炎組116例，男92例，女24例；乙肝硬化組102例，男86例，女16例；乙肝肝癌組110例，男86例，女24例。

1.2 基因組DNA的提取 采用硅膠柱純化方式，從700 μL抗凝血液中提取淋巴細(xì)胞基因組DNA。UV計(jì)測定DNA濃度及純度，并將樣本稀釋至10 ng/μL，分裝保存。

1.3 PCR-RFLP 從SNPs數(shù)據(jù)庫下載SNP的標(biāo)準(zhǔn)序列，Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游：5’-3’CCTTTGCCCAGTGTATC，下游：5’-3’TGTATGCCAAGCCATTTG（上海英濰捷基公司合成），內(nèi)切酶BclI位點(diǎn)T/GATCA（NEB公司提供）。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)35次，72 ℃延遲5 min結(jié)束PCR反應(yīng)。產(chǎn)物37 ℃過夜酶切，65 ℃ 30 min，終止反應(yīng)。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，送上海英濰捷基公司測序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算等位基因頻率和基因型頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及各組間比較均采用 χ2檢驗(yàn)，以P＞0.01表示符合H-W平衡，以P＜0.05表示各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，非條件Logistic回歸校正年齡及性別等因素，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計(jì)算比值比（Odds Ratios， OR）及其95%可信區(qū)間（Confidence Intervals，CI）表示相對危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定及測序驗(yàn)證 PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物見圖1～2。

2.2 H-W平衡判定及各基因型、等位基因的頻率分布 診斷明確的乙型肝炎患者總計(jì)426例，樣本經(jīng) χ2檢驗(yàn)，P=0.85，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg平衡，具有代表性，見表1。GG、CC和GC 3種基因型頻率及G、C等位基因頻率在樣本中的分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.113，P=0.104）。乙肝肝癌組GG基因型頻率低于乙肝攜帶組、乙肝肝硬化組、慢性乙型肝炎組，與前兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.086，P=0.285），與慢性乙型肝炎組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.152，P=0.046）；GC、CC基因型頻率高于其余三組，僅與慢性乙型肝炎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046）。慢性乙型肝炎組G等位基因頻率高于乙肝肝癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.605，P=0.018）；C等位基因頻率低于其余三組，僅與乙肝肝癌組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。

根據(jù)非條件Logistic回歸校正年齡、性別混雜因素，以乙肝肝癌組為病例組分別與其他組比較進(jìn)行分層分析，HMGB1基因位點(diǎn)1176G/C基因多態(tài)性在乙肝肝癌組與乙肝攜帶者組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.301，95%CI：0.092-0.989，P=0.048，Recessive model）；乙肝肝癌組與慢性乙型肝炎組（OR=3.792，95%CI：1.206-11.919，P=0.023，Dominant model）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝癌組與輕型肝病組（乙肝病毒攜帶組+慢性乙型肝炎組）（OR=0.227，95%CI：0.061-0.852，P=0.028，Dominant model；OR=0.225，95%CI：0.058-0.866，P=0.03，Codominant model）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

圖1 PCR產(chǎn)物

圖2 酶切產(chǎn)物

表1 HBV感染人群的HMGB1 1176G/C基因多態(tài)性

表2 HMGB1基因位點(diǎn)1176G/C與HBV感染關(guān)聯(lián)分析

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，病因尚未確定，目前主要認(rèn)為與肝炎病毒、致癌物質(zhì)、飲水污染、寄生蟲病等眾多環(huán)境因素及遺傳因素有關(guān)。肝癌有明顯的家族聚集現(xiàn)象，其本質(zhì)是因?yàn)檫z傳因素和肝癌之間存在明顯的相關(guān)性。通過遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變引起原癌基因活化和抑癌基因滅活是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的重要生物學(xué)過程。我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存有導(dǎo)致肝癌的易感基因，此舉拉開了研究肝癌相關(guān)易感基因的帷幕[20]。

HMGB1基因位于13q12染色體上，編碼產(chǎn)物HMGB1已被證實(shí)參與了HBV感染后肝癌發(fā)生的過程，Yan等[12]指出HMGB1通過激活TLR4和RAGE信號通路，促進(jìn)肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)HMGB1 mRNA及蛋白在肝癌組織中表達(dá)最高，指出HMGB1的過度表達(dá)是肝癌發(fā)病的一個(gè)重要因素。繼Kornblit等[14]人首次報(bào)道HMGB1基因總共存在6個(gè)SNP和4種基因突變后，其基因多態(tài)性與SIRS、同種異體T細(xì)胞移植免疫反應(yīng)、產(chǎn)后膿毒癥、MODS等多種疾病的相關(guān)性已被陸續(xù)報(bào)道[15-18]。Deng等[19]在研究HMGB1 1176G/C多態(tài)性與HBV感染臨床表型的關(guān)聯(lián)性分析中指出GG基因型人群對慢性乙型肝炎、肝硬化、急性乙型肝炎的易感性高于CC、GC基因型人群，G等位基因的HBV感染風(fēng)險(xiǎn)明顯高于C等位基因，但與HBV感染后肝癌的關(guān)聯(lián)性未予報(bào)道。

本研究結(jié)果提示，HMGB1 intron4 1176G/C多態(tài)性與HBV感染后HCC的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。攜帶GG基因型的人群對HBV感染后HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)度增加，該慢性乙型肝炎人群更易發(fā)展成乙肝后肝癌，而攜帶CC基因型的人群感染HBV后發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)較低。G等位基因不僅與HBV感染嚴(yán)重肝病密切相關(guān)，而且與HBV感染后肝癌的發(fā)生相關(guān)。HBV感染后HCC的發(fā)生，影響因素繁多，遺傳背景尤為復(fù)雜。在分析其與HMGB1基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性時(shí)，種族和地域的差異、樣本量不足、來源局限、等位基因連鎖不平衡現(xiàn)象、基因突變特征、其他微效基因的相關(guān)影響、環(huán)境及宿主因素等諸多因素均可干擾研究結(jié)果，要考證其準(zhǔn)確性，仍需要多中心、大樣本的臨床觀察及研究。

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The Correlation of Genetic Polymorphisms of HMGB1 to Hepatitis B Virus-related Hepatocellular Carcinoma/

WANG Dan，DENG Chun-qing，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：013-016

Objective：To study the possible association of the genetic polymorphism of high mobility group protein B1 （HMGB1） 1176 G/C intron 4 with the susceptibility to hepatocellular carcinoma （HCC）after hepatitis B virus （HBV）infection.Method：110 patients with HBV-related HCC and 316 patients of HBV infection without HCC after HMGB1 intron4 1176G/C polymorphism were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length pdymo-rphism （PCR-RFLP）method， chi-square test and unconditioned logistic regression model were applied to analysis results.Result：There were significant statistically difference in the three genotypes among the HBV-related HCC group and the chronic HBV infection group（χ2=6.152，P=0.046；χ2=5.605，P=0.018）. There were significant difference （P=0.023） between HCC and CHB under the dominant model either， hepatitis group of AsC，AsC+CHB different from HCC group（P =0.048， 0.028）under the recessive model respectively. There were significant difference between HCC and AsC+CHB under codominant model（P=0.03）.Conclusion：The results suggested that the genotype of HMGB1 intron4 1176 G/C is associated with the susceptibility to HBV-induced hepatocellular carcinoma.

High mobility group protein B1； Mononucleotide； Hepatitis B virus； Polymorphisms；Hepatocellular carcinoma

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.005

2014-02-12） （本文編輯：黃新珍）

山西醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動基金（YB0605）

①山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 山西 太原 030001

鄧春青

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China