多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠免疫功能影響的試驗(yàn)

高玉紅，宋銘忻

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080）

1993年，美國(guó)輝瑞（Pfizer）公司研發(fā)人員利用突變的阿維鏈霉菌研制合成了更新一代的優(yōu)秀的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物-多拉菌素（Doramectin）[1]。這種新研制的多拉菌素是阿維菌素的第二代產(chǎn)品，其合成的機(jī)理是在阿維菌素的第25位C上引入一環(huán)己烷基而形成的[2]，多拉菌素與阿維菌素相比其優(yōu)越性在于消除率低，血藥濃度維持時(shí)間較長(zhǎng)，生物半衰期比較長(zhǎng)，生物利用率比阿維菌素更高[1-3]。

多拉菌素被認(rèn)為是目前阿維菌素族中最優(yōu)秀的內(nèi)外兼殺抗寄生蟲藥物之一，對(duì)體內(nèi)外線蟲以及體外的節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺作用[4]。有研究結(jié)果表明，5mg/kg體重對(duì)小鼠的消化道線蟲具有良好的驅(qū)殺效果[5]。

以往多拉菌素的劑型多以注射劑為主，但是由于藥物的自身特點(diǎn)，如水溶性不佳，在多拉菌素注射劑的生產(chǎn)過程中會(huì)添加助溶劑等刺激性比較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，在臨床應(yīng)用過程中會(huì)對(duì)動(dòng)物造成一定程度的刺激性[6]，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使飼養(yǎng)成本相對(duì)增加?；诖朔N原因，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲教研室自行開發(fā)研制出了更加便于應(yīng)用的多拉菌素的新劑型-多拉菌素澆潑劑。此種劑型具有操作更加簡(jiǎn)易、療效十分確切、對(duì)動(dòng)物機(jī)體的刺激性非常小等優(yōu)點(diǎn)。延長(zhǎng)藥物對(duì)寄生蟲的作用時(shí)間和增強(qiáng)藥物的療效[7]。前期研究結(jié)果表明，多拉菌素澆潑劑對(duì)家兔無任何毒性反應(yīng)，對(duì)豚鼠皮膚無刺激性反應(yīng)，不產(chǎn)生致敏作用[8]。對(duì)小鼠無致畸性，無遺傳毒性作用[9]。為了進(jìn)一步檢測(cè)多拉菌素澆潑劑應(yīng)用的安全性，進(jìn)行了免疫學(xué)方面的相關(guān)試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康昆明系小鼠175只，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：多拉菌素澆潑劑，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲教研室自行研制；FITC Rat Anti-Mouse CD4，Bioledend公 司；PE Rat Anti-Mouse CD8a，Bioledend公司；環(huán)磷酰胺（Cyclophos?phamide，Cy）New Jersey USA：1-800-ACROS-01；免疫球蛋白IgG、IgM、IgA試劑盒，購(gòu)自三維公司。

主要儀器：FACSAria流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）BD FACSDiva Software；全自動(dòng)生化分析儀（D240V）天津神州英諾華醫(yī)療科技有限公司；大容量低溫高速離心機(jī)HITACHIRXⅡSeries。

2 試驗(yàn)方法

將175只小鼠隨機(jī)分成5組：對(duì)照組（C組）：該組不用藥，每只小鼠皮膚澆潑等體積的溶劑；環(huán)磷酰胺組（Cy組）：劑量80mg/kg體重，按0.02mL/g腹腔注射4 mg/mL生理鹽水Cy溶液；低劑量組（L組）：該組每只小鼠經(jīng)皮給藥多拉菌素澆潑劑5 mg/kg體重；中劑量組（M組）：該組每只小鼠經(jīng)皮給藥多拉菌素澆潑劑15mg/kg體重；高劑量組（H組）：該組每只小鼠經(jīng)皮給藥多拉菌素澆潑劑30 mg/kg體重。C組、CY組、L組、M組、H組各組于給藥后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分別每組取5只小鼠，每只取血液200μL用于檢測(cè)小鼠血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比例變化，200μL常規(guī)方法分離血清，用于檢測(cè)血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的變化 取200μL小鼠血液于肝素抗凝管中，每個(gè)樣各取抗凝血100μL于2mLEP管中，并且再分別取100μL加入一個(gè)EP管中混勻，從混合血液中取100μL分別加入3個(gè)EP管中，作為陰性、CD4+單染、CD8+單染；加入CD4+、CD8+抗體，使血液中CD4+抗體終濃度1∶200，CD8+抗體終濃度1∶100。陰性對(duì)照不加抗體，CD4+單染只加CD4+抗體，CD8+單染只加CD8+抗體；把各管避光放入4℃、15min使相應(yīng)的淋巴細(xì)胞與抗體結(jié)合；取出后每管各加入0.5mL溶血素，避光放入30℃水浴中，30min；取出各管加入PBS1～1.5mL，850 r/min（4℃）離心10min，棄上清，每管加0.5mL 1%甲醛PBS重懸，加完輕輕吹打3～4次，避光置于冰塊中待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。整個(gè)過程應(yīng)盡量避免劇烈操作，以免造成對(duì)細(xì)胞的損傷。

2.2 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中IgG、IgA、IgM的變化 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。參數(shù)設(shè)定參照試劑說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

3.1 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠外周血CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的影響 C組、Cy組、L組、M組、H組于給藥后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d分別取小鼠外周血液，將淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性單克隆熒光抗體標(biāo)記后，在流式細(xì)胞儀上能夠根據(jù)細(xì)胞大小獲得區(qū)域明顯的淋巴細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)BDFACSDiva Software分析處理，并采用二維點(diǎn)陣圖形式表示。結(jié)果見圖1～3。

圖1 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血液CD4+百分?jǐn)?shù)的影響

圖2 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血液CD8+百分?jǐn)?shù)的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血液CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的變化，檢測(cè)結(jié)果如1～3圖所示：

Cy組CD4+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)極顯著低于C組（P＜0.01），L組和和M組CD4+百分?jǐn)?shù)在第14到21日顯著高于C組（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)雖然高于C組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。L組和M組之間CD4+百分?jǐn)?shù)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。H組CD4+百分?jǐn)?shù)低于C組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Cy組CD8+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著低于C組（P＜0.05），L組、M組、H組的CD8+淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和C組比較均未見顯著性差異（P＞0.05）。Cy組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD4+/CD8+均低于C組，L組和M組CD4+/CD8+高于C組，H組CD4+/CD8+低于C組。

圖3 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血液CD4+/CD8+的影響

3.2 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血清中IgA、IgG、IgM的影響 常規(guī)方法分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的抗體IgG、IgM、IgA的變化。參數(shù)設(shè)定參照試劑說明書進(jìn)行，結(jié)果如圖4～6所示。

圖4 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血清I gG的影響

圖5 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血清I gM的影響

小鼠血清中的IgG含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Cy組均極顯著低于C組（P＜0.01），L組、M組與C之間差異不顯著（P＞0.05），H組低于C組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。IgM、IgA與IgG檢測(cè)結(jié)果相同。

4 討論

圖6 多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠血清I gA的影響

T細(xì)胞按其表面表達(dá)CD分子的不同，分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩大亞群，所有T細(xì)胞表型均為CD3+T細(xì)胞[10]。通常情況下，正常機(jī)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量高于CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，二者的比值一般保持較為穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。李鋒等認(rèn)為正常小鼠的CD4+/CD8+的比值大約為1.6，這與本試驗(yàn)測(cè)得正常小鼠的CD4+/CD8+的比值較為接近。由于機(jī)體在受到多種環(huán)境因素刺激時(shí)，外周血T細(xì)胞亞群也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，從而使機(jī)體的免疫功能發(fā)生變化。CD4+/CD8+的比值上升，通常提示機(jī)體的免疫功能有所升高[11]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cy組CD4+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)極顯著低于C組（P＜0.01），由環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致的免疫抑制小鼠外周血中CD4+/CD8+的比值明顯下降，結(jié)果證實(shí)，環(huán)磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能，免疫抑制小鼠模型建造成功。L組和M組CD4+百分?jǐn)?shù)在第14和21日顯著高于C組（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)雖然高于C組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。L組和M組之間CD4+百分?jǐn)?shù)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。H組CD4+百分?jǐn)?shù)低于C組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。CD8+淋巴細(xì)胞百分比的變化：Cy組和C組差異顯著（P＜0.05），其他各組的CD8+淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和C組相比均未見顯著性差異（P＞0.05）?？梢哉J(rèn)為，多拉菌素澆潑劑對(duì)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能的改善作用，主要是通過調(diào)節(jié)血液中輔助性CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和CD4+/CD8+細(xì)胞的比值來實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠特異性細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。Cy組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD4+/CD8+均低于C組，L組和M組CD4+/CD8+高于C組，H組CD4+/CD8+低于C組。

說明合適劑量的多拉菌素可以調(diào)節(jié)小鼠外周血液CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比值變化。此結(jié)果可以看出，合適劑量的多拉菌素澆潑劑可以朝著有利于改善小鼠免疫功能的方向發(fā)展。合適劑量多拉菌素澆潑劑作用后，小鼠特異性細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)增強(qiáng)現(xiàn)象，那么多拉菌素澆潑劑引發(fā)的這種現(xiàn)象是通過何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的？多拉菌素澆潑劑是通過何種途徑發(fā)揮作用的？以上問題有待于進(jìn)一步研究。

體液免疫是特異性免疫的重要組成部分，在抗感染免疫中與細(xì)胞免疫相輔相成，共同發(fā)揮免疫作用。B淋巴細(xì)胞是體內(nèi)唯一能產(chǎn)生抗體免疫球蛋白分子的細(xì)胞，成熟的B淋巴細(xì)胞可分泌抗體（主要為IgG、IgM、IgA等）發(fā)揮體液免疫功能。因此，體內(nèi)IgG、IgM、IgA水平可反映機(jī)體的體液免疫功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，低、中、高劑量時(shí)，IgG、IgM、IgA與對(duì)照組比較無明顯差異（P＞0.05），高劑量時(shí)，IgG、IgM、IgA雖然低于對(duì)照組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠體液免疫功能無顯著性影響，推測(cè)多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠免疫功能的影響是以細(xì)胞免疫為主，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

多拉菌素澆潑劑在低、中、高3個(gè)劑量組時(shí)，均可以改變外周血液CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，且有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明合適劑量的多拉菌素澆潑劑可以朝著有利于改善小鼠特異性細(xì)胞免疫功能的方向發(fā)展。

低、中劑量時(shí)，IgA、IgM、IgG無明顯變化，高劑量時(shí)，IgA、IgM、IgG有所降低，但和C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明多拉菌素澆潑劑各劑量時(shí)對(duì)小鼠體液免疫均無顯著影響。推測(cè)多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠免疫功能的影響是以細(xì)胞免疫為主，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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