天然脫鎂葉綠酸a提取技術(shù)和測定方法的研究進(jìn)展

圣倩倩，祝遵凌，2

(1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué)藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，江蘇南京 210037)

卟啉類化合物是一類天然光敏活性劑［1］，在惡性腫瘤的診斷和光動力治療中發(fā)揮了較為重要的作用［2-3］。而脫鎂葉綠酸a(pheophorbide a)作為一種卟啉化合物，是高等植物和藻類的葉綠素中間代謝產(chǎn)物［4］，且已有相關(guān)報道脫鎂葉綠酸a是一種光動力復(fù)合物［5-6］，可用于光動力療法［7］。脫鎂葉綠酸a是由葉綠素分子脫去鎂離子后進(jìn)一步水解而形成的化合物，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、保護(hù)胃腸粘膜等藥理作用［8-10］。Stermitz等［11］證明了脫鎂葉綠酸 a是一種強(qiáng)有力的外排泵抑制劑。Charles等［12］研究發(fā)現(xiàn)動物糞便中含有的脫鎂葉綠酸a對腸原桿菌具有有效的外排泵抑制特性。

目前，脫鎂葉綠酸a是葉綠素降解的中間產(chǎn)物，在茶葉、柑橘、老化葉中普遍存在，但含量低、分離困難，而其需求量日益加大，這就形成了供不應(yīng)求的局面。本文綜述了國內(nèi)外近年來對脫鎂葉綠酸a的提取技術(shù)和測定方法，常見的提取技術(shù)有丙酮法［13］、乙醇法［14-16］、丙酮-乙醇法、Hynninen 選擇性酸法水解［17］、酸堿法［18］、甲醇法，測定方法有分光光度法、高效液相色譜法、薄層色譜分析法。旨在通過對脫鎂葉綠酸a化合物提取方法和測定方法的總結(jié)和比較，找出其中的優(yōu)缺點，以便能在以后的提取過程中發(fā)揮其優(yōu)勢，從而大大的提高提取效率，為以后脫鎂葉綠酸a進(jìn)一步研究、開發(fā)、應(yīng)用提供依據(jù)。

1 天然脫鎂葉綠酸a的提取方法

1.1 丙酮法

丙酮法是一種傳統(tǒng)的提取方法。丙酮作為有機(jī)溶劑，提取綠色植物葉片中的粗品葉綠素，使用30%鹽酸脫去金屬離子和植醇長鏈，得到主要產(chǎn)物脫鎂葉綠酸a。王章陽等［19］通過正交實驗法優(yōu)化丙酮法的工藝條件，2次提取蠶砂中的脫鎂葉綠酸，70℃的提取溫度，5 h以上的軟化時間，1 h的提取時間，1/10倍干藥材量的軟化用量，3倍于藥材量的溶媒用量，酸化，將pH調(diào)至2.5，60目的粉碎度，使得脫鎂葉綠酸提取率提高了4.6倍。馬士成［20］用水將蠶砂洗凈后，自然風(fēng)干，丙酮中回流提取，抽濾，收取濾液，濃縮近干，加乙醚、HCl混合液劇烈振搖后萃取，分離下層水溶液，加入冰塊，用飽和NaOH將pH調(diào)至3左右，離心，沉淀即為脫鎂葉綠酸a，離心液過濾后用EDTA滴定，測得脫鎂葉綠酸a提取率為0.3%。

1.2 乙醇法

其原理是葉綠素分子為雙羧酸的酯，一個為甲基所酯化，另一個為葉醇基所酯化，經(jīng)皂化反應(yīng)及酸化脫鎂后，得到脫鎂葉綠酸a。王章陽等［19］取中藥材蠶砂50 g，加水軟化，比例較少，用95%乙醇150 mL，10%NaOH調(diào)pH至12～13，70℃水浴提取1 h，測得提取率為0.072 6%。馬士成用水將蠶砂洗凈后攤晾近干，用95%乙醇和10%NaOH調(diào)pH，水浴提取，抽濾，收取濾液，濃縮，加水稀釋濃縮液，振搖，用石油醚萃取下層皂化物至石油醚無色，下層皂化液加30%HCl調(diào)pH至3左右，離心，沉淀即為脫鎂葉綠酸a。離心液過濾后用EDTA滴定，測得提取率0.07%。

對于丙酮法和乙醇法，王章陽和馬士成一致認(rèn)為丙酮法制備脫鎂葉綠酸a的提取率高于乙醇法。且馬士成認(rèn)為提取的最佳條件為:提取2次，70℃的提取溫度，5 h以上的軟化時間，1 h的提取時間，1/10倍于原料的軟化用量，3倍于原料的溶媒用量，酸化時調(diào)pH至2.5，60目的粉碎度，使得最后的提取率提高3.6倍。

1.3 丙酮-乙醇法

其原理是利用丙酮與乙醇按照不同比例混合作提取劑，將從綠色植物葉片中提取的葉綠素在強(qiáng)酸條件下脫去鎂離子，生成脫鎂葉綠酸。吳真等［21］認(rèn)為對蠶砂軟化時間2 h(含水量26%)、丙酮-乙醇(1∶2，v/v)作為提取葉綠素的溶劑效果最好，然后以蠶砂葉綠素粗品合成葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸，濃鹽酸脫鎂攪拌反應(yīng)72 h，最后的脫鎂葉綠酸a制備率達(dá)67%。而康玲等［22］則以蠶砂軟化時間(含水量)、不同提取溶劑為考察條件，探討濃鹽酸脫鎂時間對葉綠素合成脫鎂葉綠酸制備率的影響，結(jié)果表明，蠶砂2 h(含水量26%)的軟化時間、體積比1∶1的丙酮與乙醇作為提取葉綠素的溶劑效果最好，然后再使用蠶砂葉綠素粗品合成脫鎂葉綠酸，濃鹽酸脫鎂攪拌反應(yīng)72 h，制備率達(dá)670 mg/g。

1.4 Hynninen 選擇性酸法水解［17］

由于葉綠素a與葉綠素b水解能力不同，以30%鹽酸選擇性地使葉綠素a植物醇基酯鍵水解，葉綠素b則不水解，以達(dá)到使二者分開的目的。使用糊狀葉綠素，直接將葉綠素a水解成脫鎂葉綠一酸a，經(jīng)鹽酸與乙醚按不同比例分離，獲取脫鎂葉綠一酸a，按Hynninen公式計算脫鎂葉綠一酸的含量為88%。進(jìn)一步使用薄層色譜法提純，含量高達(dá)99%［18］。這種方法不僅提取效率高，而且所含雜質(zhì)也較少。吳真等向蠶砂葉綠素粗品中直接加鹽酸制備脫鎂葉綠酸a，收率為67.3%，比常規(guī)工藝提高3倍多。

1.5 酸堿法

其原理是用濃度較高的鹽酸水解葉綠素，主要得到脫鎂葉綠一酸a，這表明脫鎂葉綠素b的酯鍵對酸穩(wěn)定，而葉綠素a的甲酯鍵和戊酮環(huán)也穩(wěn)定。但堿水解葉綠素脫脂和開環(huán)很容易，但要提取脫鎂葉綠二酸a和脫鎂葉綠三酸a，需要設(shè)法控制堿的用量，而以堿法制備葉綠一酸a不易控制［18］。孫彩云［23］采用堿法水解制備脫鎂葉綠酸，稱量50 g蠶砂，加入30 mL水軟化5 h以上，再加入提取劑丙酮(95%)與乙醇(1∶1)混合溶液200 mL，于45℃水浴鍋中加熱2 h，進(jìn)行2次提取，然后過濾，將葉綠素提取液收集在燒瓶里，再加入10%NaOH溶液，將pH調(diào)至12左右，60℃水浴皂化回流1 h，然后減壓蒸餾并回收溶劑。將皂化液用等體積的石油醚萃取3～5次，舍去上層黃色油相，收集下層水相(墨綠色皂化液)，攪拌并滴加20%HCl溶液，將pH調(diào)至2～3，再在45℃的水浴鍋中加熱30 min，產(chǎn)生的脫鎂葉綠酸沉淀為深褐色。

1.6 甲醇法

Cheng等［24］利用甲醇提取爪哇大青中的脫鎂葉綠酸a，再利用正己烷、氯仿和乙酸乙酯對甲醇提取物進(jìn)行分餾，結(jié)合核磁共振波譜和脫鎂葉綠酸a標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，提取并測定脫鎂葉綠酸a。使用這種方法雖然工藝比較簡單，提取時間短，但提取物中含有的雜質(zhì)較多，提取效率低。

2 天然脫鎂葉綠酸a的測定方法

2.1 分光光度法

可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中脫鎂葉綠酸a的含量。進(jìn)行含量測定時選擇脫鎂葉綠酸a的最大吸收波長，這樣做一方面靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異，另一方面可以避免其它物質(zhì)的干擾。此外，分光光度法具有簡便快捷，且對儀器設(shè)備要求不高等優(yōu)點［25］。王永等［26］使用可見分光光度計測定大麥苗粉中脫鎂葉綠酸a的含量時，根據(jù)脫鎂葉綠酸可溶于乙醚的性質(zhì)，以乙醚作對照，由于其在667 nm處有最大吸收蜂，故選定667 nm作為測定波長測定樣品的吸光值。而Ewa Cieckiewicz等研究歐洲鵝耳櫟葉片中的脫鎂葉綠酸a，得出紫外/可見光譜在408 nm有一個很強(qiáng)的吸收峰，666 nm有一個較小的吸收峰。孫彩云［23］采用紫外-可見分光光度計(UVVis)掃描已提取的脫鎂葉綠酸的吸收曲線。James等［27］通過對不同濃度的涼拌卷心菜提取液使用分光光度計進(jìn)行測定，表明酸性條件下其提取液內(nèi)的脫鎂葉綠酸a含量較高。Frank等［28］利用可見光吸收光譜和核磁共振分析從茵陳蒿中提取出脫鎂葉綠酸a。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達(dá)4.910 7 Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。目前多使用制備型高效液相色譜法測定脫鎂葉綠酸單體的含量，制備型高效液相色譜法具有制備量大、產(chǎn)率和純度高、分離速度快等特點，但該方法由于在流動相中大多使用高濃度的緩沖鹽或酸，對系統(tǒng)特別是液相柱損害較大。李洪玉等［29］采用HPLC法測定竹葉葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸a的含量時，填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠，色譜柱:C18 diamonsil 5 μL(150 mm × 4.6 mm I.D)，流動相:MeOH-HAc(10∶0.1)，409 nm 的紫外檢測波長，定量分析脫鎂葉綠酸a，這種方法簡單、快速、準(zhǔn)確，適用于脫鎂葉綠酸a含量的測定和質(zhì)量控制。吳方評等［30］用90%丙酮振蕩并提取煙草中含有的脫鎂葉綠素，將提取液在Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱上預(yù)分離和富集，固定相為Waters Xterra TM RP18(1.0 mm ×50 mm，2.5 m)色譜柱，流動相為(1+1)甲醇異丙醇溶液-水梯度，煙葉中的脫鎂葉綠素將在其最大吸收波長下分離提取，最后通過色譜峰面積來計算含量。

2.3 薄層色譜法

薄層層析法也稱薄層色譜法(thin-layer chromatography)，是快速分離和定性分析少量物料的一種非常重要的技術(shù)，常用TLC表示。TLC是色譜技術(shù)的一種。與經(jīng)典的分離提純手段(重結(jié)晶、升華、萃取和蒸餾等)相比，薄層色譜法具有微量、快速、分離效率高和靈敏度高等優(yōu)點，但在分辨率及重現(xiàn)性等方面不如高效液相色譜法和氣相色譜法，一般用作定性和半定量的手段［31］。Rf值的大小與展開劑的極性有很大關(guān)系，常用的展開劑有石油醚、四氯化碳、甲苯、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸等［32］。徐磊［33］通過采集香樟樹葉，從中提取葉綠素，展開劑為四氯化碳、丙酮、甲酸(14∶7∶1)，使用薄層層析法(TLC)對脫鎂葉綠酸 a進(jìn)行純化，進(jìn)行定量分析。紀(jì)平雄等使用相關(guān)報道的薄層層析展開劑(四氯化碳∶丙酮∶甲酸 =70∶29∶1)在硅膠薄板上不能將蠶砂中含有的脫鎂葉綠酸a成分分開，而使用比例為14∶7∶1時，該展開劑能有效地將脫鎂葉綠酸a分開，效果明顯優(yōu)于相關(guān)報道的展開劑比例。而Ewa等以二氯甲烷和乙酸乙酯(9∶1)為展開劑對歐洲鵝耳櫟的脫鎂葉綠酸a進(jìn)行分離和純化的效果良好。說明展開劑的選擇需要根據(jù)特定的植物性質(zhì)而定。

3 結(jié)束語

本文總結(jié)出的幾種提取脫鎂葉綠酸a的方法雖然方法簡單易行，但均比較傳統(tǒng)，提取效率低，仍需要科研工作者進(jìn)行進(jìn)一步探索脫鎂葉綠酸a的分離純化方法，由于自然界含有脫鎂葉綠酸a的藥用植物種類數(shù)量繁多，作為植物次生代謝產(chǎn)物的一大類家族，具有光動力作用，是一種潛在的抗癌物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此在未來的研究中對富含脫鎂葉綠酸a結(jié)構(gòu)的植物進(jìn)行深入研究，以期能夠與抗癌藥物結(jié)合起來，共同促進(jìn)人類生物醫(yī)學(xué)方面的發(fā)展。

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