臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法空白限、檢出限和定量限評(píng)價(jià)新方法

衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（100730） 康鳳鳳 王 薇 王治國(guó)

臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法空白限、檢出限和定量限評(píng)價(jià)新方法

衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（100730） 康鳳鳳 王 薇 王治國(guó)△

臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的下限性能是非常關(guān)鍵的，尤其是當(dāng)分析物在低濃度水平有重要臨床意義時(shí)。最早采用術(shù)語“分析靈敏度”，即可檢測(cè)的最低分析物濃度，該定義僅基于空白樣本的重復(fù)試驗(yàn)。同時(shí)出現(xiàn)的另一術(shù)語為“功能性靈敏度”，即測(cè)量程序長(zhǎng)期不精密度（coefficient of variation，CV）為20%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度水平，該定義基于精密度分布圖。2004年，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院（CLSI）頒布了EP17-A文件：檢出限和定量限的測(cè)定方案；批準(zhǔn)指南［1］；2012年6月，CLSI又頒布了EP17-A2文件：臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)量程序檢測(cè)能力評(píng)價(jià)；批準(zhǔn)指南（第二版）［2］。由于“分析靈敏度”與術(shù)語“檢出限”或“檢測(cè)下限”在一定程度上可互換，而“功能性靈敏度”又易與術(shù)語“臨床靈敏度”、“閾值”等混淆，因此這兩個(gè)文件推薦了新的術(shù)語描述檢測(cè)下限性能：空白限（limit of blank，LoB）、檢出限（lim it of detection，LoD）和定量限（limit of quantitation，LoQ）。LoB定義為空白樣本的系列結(jié)果中的最大值；LoD定義為方法可檢出的最低被測(cè)物濃度；LoQ定義為能可靠檢出分析物且檢測(cè)結(jié)果的不確定度滿足實(shí)驗(yàn)室既定目標(biāo)的實(shí)際濃度。

目前，檢測(cè)下限性能評(píng)價(jià)方法主要為EP17-A指南推薦的經(jīng)典法，但該方法僅適用于定量檢測(cè)方法，要求數(shù)據(jù)具有方差齊性。最新頒布的EP17-A2指南提出了兩種新的方法：精密度分布圖和概率單位法（probit法）。本文將結(jié)合具體實(shí)例，探討臨床實(shí)驗(yàn)室如何使用這3種方法建立LoB，LoD和LoQ。

空白限和檢出限

1.經(jīng)典法

該方法由EP17-A文件中提出，要求各低濃度樣本的測(cè)量結(jié)果具有方差齊性。LoB由空白樣本的結(jié)果確定，檢測(cè)結(jié)果高于該值為真正空白樣本的可能性很小。此處可能犯Ⅰ類錯(cuò)誤，即真正空白樣本錯(cuò)誤判斷為陽性樣本，其風(fēng)險(xiǎn)為α。相反，真正低濃度樣本可能被錯(cuò)誤判斷為陰性樣本，即犯Ⅱ類錯(cuò)誤，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)為β。實(shí)際應(yīng)用中，通常假設(shè)α＝β＝0.05，臨床實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)特定測(cè)量程序確定合理的α和β。

（1）研究設(shè)計(jì) 以雌二醇免疫法測(cè)量程序?yàn)槔?，默認(rèn)α＝β＝0.05?？瞻讟颖緛碓唇】等巳貉鍢?biāo)本，利用免疫吸附法去除內(nèi)源性雌二醇。利用濃度為0 pg/m l的校準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性研究（n＝20）。測(cè)量結(jié)果的最大值為7pg/m l，以此作為L(zhǎng)oB初始估計(jì)值，并確定低濃度樣本的期望范圍為7～35pg/m l（LoB的1～5倍）。選擇5個(gè)空白樣本和5個(gè)低濃度樣本，分別用兩個(gè)批號(hào)的試劑對(duì)各個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)，每天重復(fù)檢測(cè)4次，連續(xù)檢測(cè)3天，最終每個(gè)試劑批號(hào)分別有60個(gè)空白結(jié)果和低濃度結(jié)果。

（2）數(shù)據(jù)分析

①LoB估計(jì) 采用非參數(shù)方式計(jì)算LoB［3］：

1）將60個(gè)空白樣本的檢測(cè)結(jié)果按從小到大的方式進(jìn)行排序；

2）α＝0.05，計(jì)算空白樣本結(jié)果分布的百分位數(shù)（Pct），即Pct＝0.95；

3）根據(jù)Pct計(jì)算空白樣本的排列位置，即排列位置＝0.5＋60×0.95＝57.5。排列位置必須是整數(shù)，應(yīng)根據(jù)第57和58位的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，LoB＝X57＋0.5（X58-X57）。兩個(gè)批號(hào)試劑對(duì)應(yīng)的LoB估計(jì)值分別為7.6pg/m l和9.4pg/m l。將兩個(gè)批號(hào)的較大值作為最終的LoB估計(jì)值，即9.4pg/m l。注意如果研究包含4個(gè)或以上的試劑批號(hào)，可直接用所有數(shù)據(jù)按步驟1）～3）計(jì)算LoB，因?yàn)?個(gè)以上的試劑批號(hào)已很大程度降低了批間變異。

②LoD估計(jì) LoD估計(jì)多采用參數(shù)分析法，如果低濃度樣本測(cè)量結(jié)果不具方差齊性，可采用非參數(shù)分析法或下文的精密度分布圖。

1）分別對(duì)每個(gè)試劑批號(hào)的每個(gè)低濃度樣本計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（si）；

2）計(jì)算每個(gè)試劑批號(hào)的J個(gè)低濃度樣本的總標(biāo)準(zhǔn)差（sL）

（si為第i個(gè)低濃度樣本所有結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，ni為第i個(gè)低濃度樣本所有結(jié)果數(shù)，J為低濃度樣本數(shù)）；

3）計(jì)算LoD：LoD＝LoB＋cpsL，cp＝為正態(tài)分布95百分位數(shù)的乘數(shù)因子，L為所有試劑批號(hào)所有低濃度樣本結(jié)果總數(shù)；

4）計(jì)算過程與結(jié)果如表1所示，兩個(gè)批號(hào)的LoD估計(jì)值分別為14.5pg/m l和13.8 pg/m l，取較大的14.5 pg/m l作為測(cè)量程序的最終LoD估計(jì)值。

表1 LoD估計(jì)（單位pg/m l）

2.精密度分布圖

精密度分布圖是以系列濃度水平為橫坐標(biāo)，以濃度水平相應(yīng)的不精密度為縱坐標(biāo)的函數(shù)關(guān)系曲線，表示分析系統(tǒng)對(duì)不同濃度樣本的精密度差異。該方法僅用于LoD的測(cè)定，尤其適用于測(cè)量結(jié)果在假定LoD附近的變異很大，或者臨床實(shí)驗(yàn)室未對(duì)LoD進(jìn)行明確估計(jì)，期望獲得更寬的測(cè)量濃度范圍［4］。精密度分布圖最早用于功能性靈敏度的測(cè)定，后來逐漸發(fā)展成為一模型，用于其他分析物，如甲狀腺激素、前列腺特異性抗原（prostatic specific antigen，PSA）等。

（1）研究設(shè)計(jì) 以PSA免疫學(xué)試驗(yàn)為例，初步精密度試驗(yàn)顯示該測(cè)量程序變異性隨著分析物濃度增加而增大，采用精密度分布圖評(píng)價(jià)LoD。利用免疫吸附法去除血清樣本中的內(nèi)源性分析物作為空白樣本，經(jīng)典法計(jì)算LoB估計(jì)值為0.51ng/m l。選擇至少5個(gè)低濃度樣本，每天分別用兩個(gè)批號(hào)的試劑對(duì)各個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)5次，連續(xù)檢測(cè)5天。

（2）數(shù)據(jù)分析

①按照CLSIEP05文件中描述的方法，計(jì)算各樣本的均值和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度（sWL）的估計(jì)值［5］，如表2所示；

②選擇合適的模型擬合精密度分布圖數(shù)據(jù)，初步觀察該曲線為二階多項(xiàng)式，利用excel執(zhí)行多項(xiàng)式模型回歸：sWL＝0.3741＋0.0149X＋0.0055X2（批號(hào)1），sWL＝0.2801＋0.0817X＋0.0017X2（批號(hào)2），精密度分布圖見圖1；

③從LoB分析物濃度開始，根據(jù)精密度分布圖模型計(jì)算預(yù)期實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度（sWL），按公式計(jì)算LoD：LoD＝LoB＋cpsWL，計(jì)算cp＝1.646。LoD＝0.51＋ 1.646×（0.3741＋0.0149×0.51＋0.0055×0.512）＝1.14（批號(hào)1），LoD＝0.51＋1.646×（0.2801＋0.0817 ×0.51＋0.0071×0.512）＝1.047（批號(hào)2）。批號(hào)1和批號(hào)2的LoD估計(jì)值都不等于起始分析物濃度0.51ng/m l，因此從0.50 ng/m l開始，每次增加0.1，逐漸增加分析物濃度，計(jì)算預(yù)期sWL及相關(guān)的LoD，直到得到一個(gè)擬合的LoD估計(jì)值的分析物濃度；

④選擇兩個(gè)批號(hào)中較大者作為最終的LoD估計(jì)值，報(bào)告該測(cè)量程序的LoD為1.16ng/m l。。

表2 各樣本測(cè)量均值和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異（單位ng/m l）

圖1 兩個(gè)試劑批號(hào)的精密度分布圖

3.概率單位法（probit法）

該方法適用于當(dāng)測(cè)量程序的檢測(cè)能力以比例（陽性結(jié)果數(shù)/重復(fù)檢測(cè)的總數(shù)）的形式表示時(shí)，最早應(yīng)用于殺蟲效率的評(píng)價(jià)，目前已廣泛用于其他領(lǐng)域中［6-7］。典型的probit法遵循有限稀釋的劑量-反應(yīng)方案，即從已知測(cè)量濃度的樣本開始作一系列稀釋，然后測(cè)量程序?qū)@些稀釋物進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，得到兩種結(jié)果：檢出或未檢出。對(duì)每個(gè)稀釋濃度，計(jì)算“檢出”測(cè)量結(jié)果數(shù)/總的重復(fù)測(cè)量數(shù)的比例（命中率）。將這些命中率轉(zhuǎn)化為累積正態(tài)概率單位，并用回歸模型對(duì)各自的測(cè)量濃度進(jìn)行修勻。最后用回歸模型計(jì)算預(yù)期命中率（如0.95）的測(cè)量濃度，即LoD。該方法尤其適用于分子檢測(cè)或其他利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)的測(cè)量程序，其沒有陰性樣本結(jié)果的分布，LoB通常報(bào)告為0。

（1）研究設(shè)計(jì) 以檢測(cè)細(xì)菌DNA的分子診斷試驗(yàn)為例，對(duì)某患者樣本進(jìn)行系列稀釋得到5個(gè)稀釋度，分別用3個(gè)試劑批號(hào)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，每天重復(fù)檢測(cè)2次，連續(xù)檢測(cè)3天，保證獲得至少20個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果。

（2）數(shù)據(jù)分析

①取α＝β＝0.05；默認(rèn)LoB為0，用陰性患者樣本進(jìn)行確認(rèn)，即某個(gè)試劑批號(hào)的陰性樣本檢測(cè)結(jié)果為0的比例大于100（1-α）%，或者用經(jīng)典法估計(jì)LoB；

③利用專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件（如SPSS等）進(jìn)行probit回歸分析，以分析物濃度為X軸，命中率為Y軸，繪制probit曲線。選擇Pearson卡方檢驗(yàn)和對(duì)數(shù)似然比卡方檢驗(yàn)檢測(cè)probit模型的吻合性。圖2～4分別為3個(gè)試劑批號(hào)的probit曲線。

④模型擬合可接受，通過曲線查找通常0.95命中率下的分析物濃度，將該值作為特定批號(hào)的LoD。3個(gè)試劑批號(hào)的LoD分別為0.077 CFU/m l、0.033 CFU/m l和0.031 CFU/m l，將最大值0.077CFU/m l作為測(cè)量程序的最終LoD估計(jì)值。

表3 各樣本命中率結(jié)果

圖2 probit曲線（批號(hào)1）

圖3 probit曲線（批號(hào)2）

定量限

建立測(cè)量程序時(shí)應(yīng)建立LoQ，臨床實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇特定的準(zhǔn)確度目標(biāo)，通常以允許總誤差（total error allowable，TEa）目標(biāo)或偏倚和精密度目標(biāo)的形式進(jìn)行定義。

圖4 probit曲線（批號(hào)3）

1.研究設(shè)計(jì)

仍以免疫法雌二醇測(cè)量程序?yàn)槔?，基于?jīng)典方法測(cè)定LoD。其準(zhǔn)確度目標(biāo)TEa＝21.6%，后者根據(jù)C.Ricos教授提供的生物學(xué)變異數(shù)據(jù)庫建立的適當(dāng)?shù)脑试S總誤差質(zhì)量規(guī)范［8］。采用經(jīng)典的Westgard模型定義總誤差（total error，TE）［9-10］利用前文的LoB/LoD數(shù)據(jù)，選擇一個(gè)靶濃度作為試驗(yàn)LoQ，LoQ應(yīng)大于LoD。根據(jù)該濃度制備多個(gè)低濃度樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，本例為4個(gè)樣本，用2個(gè)試劑批號(hào)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，每天檢測(cè)3次，連續(xù)檢測(cè)3天。

2.數(shù)據(jù)分析

（2）利用Westgard TE模型計(jì)算每個(gè)試劑每個(gè)樣本的TE，如表4所示。將每個(gè)試劑批號(hào)的TE估計(jì)值與既定準(zhǔn)確度目標(biāo)進(jìn)行比較，以滿足準(zhǔn)確度目標(biāo)的最低濃度作為該批號(hào)的LoQ；

表4 低濃度樣本的觀察均值、標(biāo)準(zhǔn)差和總誤差

（3）本例中所有樣本的TE都不滿足21.6%。作分析物濃度總誤差分布圖（線性回歸模型），如圖5所示，推測(cè)準(zhǔn)確度目標(biāo)21.6%對(duì)應(yīng)的濃度約為35pg/m l。制備靶濃度為40pg/m l的5個(gè)混合樣本，用ID-GC/MS檢測(cè)得到參考值，并確認(rèn)其在期望分析物濃度范圍內(nèi)（40±10 pg/m l）。用2個(gè)試劑批號(hào)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，每天檢測(cè)3次，連續(xù)檢測(cè)3天，重復(fù)步驟（1）和（2）；

圖5 分析物濃度總誤差分布圖

表5 各樣本總誤差及定量限的計(jì)算過程

臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)廠家提供的檢測(cè)下限性能聲明，根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)和研究數(shù)據(jù)的分布特性，選擇合適的方法設(shè)計(jì)LoB、LoD和LoQ的研究方案。研究方案的設(shè)計(jì)可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)節(jié)，但必須滿足最低的重復(fù)檢測(cè)數(shù)要求。

1.CLSI.Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation；Approved Guideline.CLSI document EP17-A.Wayne，PA： Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

2.CLSI.Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP17-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

3.王治國(guó)主編.臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

4.Ekins RP.The“precision profile”：its use in RIA assessment and design.Ligand Quarterly，1981，4（2）：33-44.

5.CLSI.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP05-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

6.Bliss CI.Themethod of probits.Science，1934，79（2037）：38-39.

7.Burd EM.Validation of labor atory-developed molecular assays for infectious diseases.Clin M icrobiol Rev，2010，23（3）：550-576.

8.Ricos C，Iglesias N，Garcia-Lario JV，et al.W ithin-subject biological variation in disease：collated data and clinical consequences.Ann Clin Biochem.2007，44（4）：343-352.http：//www.westgard.com/biological-variation-in-patients-w ith-disease.htm.Accessed May 14，2012.

9.Westgard JO，Carey RN，Wold S.Criteria for judging precision and accuracy in method development and evaluation.Clin Chem，1974，20（7）：825-833.

10.Petersen PH，St?ckl D，Westgard JO，et al.Models for combining random and systematic errors：assumptions and consequences for different models.Clin Chem Lab Med，2001，39（7）：589-595.

（責(zé)任編輯：劉 壯）

△通信作者：王治國(guó)，E-mail：zhiguo_w＠hotmail.com