知母皂苷AⅢ對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響Δ

潘會(huì)君，莫小輝，馮彥軍，陳中建，陳 松，秦路平（.上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 00；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室，上海 00；.上海市皮膚病醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 00；.蘇州市第五人民醫(yī)院，江蘇蘇州 5000）

據(jù)預(yù)測(cè)2000－2050年，全球癌癥新發(fā)患者將以每年2倍的速度遞增，治療費(fèi)用在未來(lái)10年將增加800億美元[1]，為改善腫瘤治療現(xiàn)狀，各國(guó)以及各大制藥公司都在加大開(kāi)發(fā)腫瘤藥物的研發(fā)力度。自1971年Judan Folkman首次提出“腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成”的假說(shuō)以來(lái)[2]，血管生成在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的作用逐漸明朗。Douglas Hanahan和Robert A.Weinberg先后撰文描述腫瘤特征，將血管生成（Sustained Angiogenesis）學(xué)說(shuō)明確提出[3]，揭示了血管生成在腫瘤生長(zhǎng)中的重要地位。

知母皂苷AⅢ為中藥知母中甾體皂苷類成分，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)部分腫瘤細(xì)胞有很好的抑制作用：（1）通過(guò)線粒體介導(dǎo)誘發(fā)Hela腫瘤細(xì)胞凋亡[4]；（2）通過(guò)自噬機(jī)制抑制Hela腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]；（3）誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞BT474凋亡[6]；（4）誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞凋亡和阻止細(xì)胞周期；（5）抑制HCT-15細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)[7]。

本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），觀察知母皂苷AⅢ對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為研究其抗血管作用提供前期數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

HF90/HF240型CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；40R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；EPICS XL分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ELX800NB型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

知母皂苷AⅢ（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：070503，純度：≥98%）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；RPMI Medium 1640、胰蛋白酶、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡測(cè)試盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 細(xì)胞株

HUVEC由蘇州市第五人民醫(yī)院馮彥軍醫(yī)師饋贈(zèng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs于37 ℃下，在5%CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度為5 000/孔。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h后，加入0（即空白對(duì)照）、1、2、4、8 μmol/L濃度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝（空白對(duì)照A－用藥A）/空白對(duì)照A×100%。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種細(xì)胞于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h后，加入0、1、2、4、8 μmol/L濃度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于24孔板，分別加入0、4、8 μmol/L藥物作用24 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl，混勻于室溫避光孵育15 min，收集到流式管中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的抑制作用

終濃度分別為1、2、4、8 μmol/L的知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，并與時(shí)間、濃度呈正比。計(jì)算可知，知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為7.2、4.0、2.0 μmol/L。知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)表1。

表1 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

表1 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs生長(zhǎng)的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

與0 μmol/L比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.0 μmol/L：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs細(xì)胞形態(tài)的影響

低倍鏡（100×）可見(jiàn)，8 μ mol/L知母皂苷A Ⅲ處理HUVECs 24、48、72 h后細(xì)胞逐漸固縮，細(xì)胞減少。高倍鏡（400×）可見(jiàn)，2 μmol/L知母皂苷處理AⅢHUVECs 24 h后逐漸出現(xiàn)空泡，4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ處理HUVECs明顯出現(xiàn)空泡。知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs細(xì)胞形態(tài)的影響見(jiàn)圖1。

3.3 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs凋亡的促進(jìn)作用

知母皂苷AⅢ作用于HUVECs 24 h，其IC50為7.17 μmol/L，因此本研究選用接近IC50和2 IC50，即4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ。與0 μmol/L比較，8 μmol/L濃度下知母皂苷AⅢ可明顯提高HUVEC凋亡率（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2[圖中左下象限顯示活細(xì)胞（LL：Annexin Ⅴ－/PI－）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞（LR：Annexin Ⅴ+/PI－）；右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（UR：Annexin Ⅴ+/PI+）；而左上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞（UL：Annexin Ⅴ－/PI+）。凋亡細(xì)胞為右上象+右下象]；知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs凋亡的影響見(jiàn)表2。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，知母皂苷AⅢ對(duì)體外培養(yǎng)HUVECs有明顯抑制作用，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也證明了這一點(diǎn)。高倍鏡下可見(jiàn)從知母皂苷AⅢ2 μmol/L開(kāi)始HUVECs即出現(xiàn)空泡，隨著濃度的加大，空泡逐漸明顯。李梢等[8-9]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ可能具有抗血管作用，并采用VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，發(fā)現(xiàn)其具有抑制作用，與本研究直接采用HUVECs觀察到相同的現(xiàn)象，提示其抗血管作用可能不完全依賴血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

已有研究顯示，知母皂苷AⅢ能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其抑制VEGF增殖的作用與促進(jìn)細(xì)胞凋亡是否有關(guān)？為了驗(yàn)證此想法，筆者采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)HUVECs凋亡的影響，選用接近IC50和2 IC50，即4、8 μ mol/L知 母皂苷A Ⅲ作 用HUVECs 24 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，知母皂苷AⅢ能誘導(dǎo)部分HUVECs凋亡，可初步推測(cè)其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

圖1 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs細(xì)胞形態(tài)的影響A.作用24、48、72 h（100×）；B.作用24 h（400×，箭頭為細(xì)胞空泡）Fig 1 Effect of timosaponin AⅢon morphology of HUVECsA.treated for 24 h，48 h and 72 h（100×）；B.treated for 24 h（400×，arrowhead means cell vacuoles）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果A.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/LFig 2 Results of flow cytometry testA.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/L

正常成人除了創(chuàng)傷愈合及生殖周期外，幾乎所有新生血管生成都是病理性的，如腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病及視網(wǎng)膜病變等[10]。筆者推測(cè)知母皂苷AⅢ對(duì)內(nèi)皮系統(tǒng)的抑制作用有可能是其對(duì)血管增生性疾病具有廣譜對(duì)抗作用。下一步需要加強(qiáng)血管增生性疾病動(dòng)物模型及相關(guān)血管生成分子靶點(diǎn)的研究，以驗(yàn)證該假說(shuō)。

表2 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

表2 知母皂苷AⅢ對(duì)HUVECs凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

與0 μmol/L比較：＊P＜0.05vs.0 μmol/L：＊P＜0.05

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