手性農(nóng)藥獸藥免疫分析研究進(jìn)展

曾皓鵬，雷紅濤*，張熾堅(jiān)，孫遠(yuǎn)明，徐振林，楊金易

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省食品安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)控制工程技術(shù)研究中心，華南家禽疫病防控與產(chǎn)品安全協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510642）

手性農(nóng)藥獸藥免疫分析研究進(jìn)展

曾皓鵬，雷紅濤*，張熾堅(jiān)，孫遠(yuǎn)明，徐振林，楊金易

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省食品安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)控制工程技術(shù)研究中心，華南家禽疫病防控與產(chǎn)品安全協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510642）

手性藥物對(duì)映異構(gòu)體在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和毒性作用等具有立體選擇性差異，因此從對(duì)映體形態(tài)水平上加強(qiáng)手性農(nóng)藥獸藥的分析 研究十分必要。免疫分析法簡(jiǎn)單快捷、特異性高、靈敏度高，因而成為手性農(nóng)藥獸藥分析研究的熱點(diǎn)。本文介紹了近年來(lái)免疫分析法在手性農(nóng)藥獸藥分析檢測(cè)方面的應(yīng)用情況，綜述了抗體立體選擇識(shí)別性、分子模擬技術(shù)及定量構(gòu)效關(guān)系等在手性藥物免疫識(shí)別機(jī)制研究中應(yīng)用，并展望手性免疫分析技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)。

手性；農(nóng)藥；獸藥；免疫分析；識(shí)別機(jī)制

20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著立體化學(xué)的發(fā)展，農(nóng)藥獸藥的研究和開(kāi)發(fā)逐漸深入到了分子立體異構(gòu)領(lǐng)域，單一手性體農(nóng)藥獸藥相繼出現(xiàn)在市場(chǎng)上。目前世界上使用的商用農(nóng)藥中有25%具有手性中心[1]，而我國(guó)由于大量使用擬除蟲(chóng)菊酯（pyrethroids）、有機(jī)磷（organophosphorus）及異丙甲草胺（metolachlor）等具有手性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，因而這一比例估計(jì)將超過(guò)40%[2]。如就農(nóng)藥總量而言，則已有超 過(guò)60%的農(nóng)藥為手性農(nóng)藥。

過(guò)去在研究手性農(nóng)藥和獸藥的藥效、環(huán)境污染行為以及生態(tài)效應(yīng)時(shí)，人們簡(jiǎn)單地將其外消旋體當(dāng)作純的單一化合物看待，即便在發(fā)達(dá)國(guó)家，其環(huán)境管理的相關(guān)法律法規(guī)也是如此。隨著農(nóng)藥獸藥毒理學(xué)在對(duì)映體形態(tài)水平上的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)雖然手性藥物的對(duì)映異構(gòu)體具有相同的理化性質(zhì)，但由于蛋白質(zhì)、酶、核酸、磷脂質(zhì)、糖類(lèi)等生物大分子具有高度專(zhuān)一的立體選擇性，因而手性藥物對(duì)映異構(gòu)體與生物體內(nèi)的酶、受體、離子通道等作用靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的立體選擇性。這表明手性藥物對(duì)映異構(gòu)體在生命體內(nèi)的吸收、代謝、藥理作用及生物效應(yīng)（如致畸、致癌、致突變、內(nèi)分泌干擾活性）[3]等方面可能會(huì)表現(xiàn)出較大的差異。例如除草劑異丙甲草胺，其S-構(gòu)型具有除草活性，而R-構(gòu)型卻可致突變；三唑類(lèi)殺菌劑（paclobutrazol）（2S，3S）-構(gòu)型具有高殺菌、低植物生長(zhǎng)抑制作用，而（2R，3R）-構(gòu)型卻有相反的作用；殺蟲(chóng)劑溴氰菊酯有3 個(gè)手性中心8 個(gè)異構(gòu)體，活性最高的異構(gòu)體（3R，1R，S）的活性是活性最差異構(gòu)體（3S，1S，R）的70多倍；氧氟沙星S-構(gòu)型的抗菌活力是R-構(gòu)型的8～12 倍，且R-構(gòu)型的氧氟沙星毒性較大。如今，手性藥物對(duì)映異構(gòu)體的安全性評(píng)價(jià)日益受到重視，美國(guó)、日本以及歐洲一些國(guó)家均已要求在農(nóng)藥新品種登記或再登記中，凡涉及手性化合物時(shí)必須提供其對(duì)映異構(gòu)體的生物試驗(yàn)報(bào)告及對(duì)映體分離技術(shù)資料，一些歐洲國(guó)家甚至已經(jīng)開(kāi)始禁用外消旋體[4]。

為了準(zhǔn)確地測(cè)定手性農(nóng)藥獸藥的手性純度，在對(duì)映體形態(tài)水平上科學(xué)地評(píng)價(jià)其對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)的安全性和風(fēng)險(xiǎn)性，研究和發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便的手性藥物對(duì)映體分析方法十分重要。目前，國(guó)內(nèi)外用于手性藥物分析研究的方法主要有以高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-10]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[11-15]、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）[16-17]和超臨界流體色譜法（supercritical fluid chromatography，SFC）[18]為主的色譜分析法和免疫分析法（immunoassays）等。雖然色譜分析法在手性農(nóng)藥獸藥的拆分上應(yīng)用比較廣泛，但該方法對(duì)選用的手性選擇劑要求比較高， 需要考慮固定相、流動(dòng)相、柱溫、流速、測(cè)試物等因素，且操作過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要投入大量經(jīng)費(fèi)。因此，為了實(shí)現(xiàn)快速批量分析手性農(nóng)藥和獸藥，人們研究建立了免疫分析法，并借助計(jì)算機(jī)技術(shù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從三維空間上研究手性藥物分子的空間構(gòu)型和性能，以了解生命過(guò)程中手性藥物分子構(gòu)型與受體間的關(guān)系和生化反應(yīng)過(guò)程中手性藥物分子構(gòu)型與立體選擇性之間的關(guān)系。本文介紹了目前免疫分析法在手性農(nóng)藥獸藥檢測(cè)分析上的應(yīng)用情況，同時(shí)對(duì)手性抗體識(shí)別性、分子模擬技術(shù)及定量構(gòu)效關(guān)系等在手性藥物免疫識(shí)別機(jī)制研究的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)手性免疫分析未來(lái)的研究和應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 免疫分析法在手性農(nóng)藥獸藥分析中的應(yīng)用

免疫分析法是基于抗原與抗體特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)，把抗體作為生物化學(xué)檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)樣品中微量的化合物、酶或蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，具有特異性好、靈敏度高、方便快捷、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)90年代以來(lái)，它在糧食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中農(nóng)藥獸藥的殘留分析上得到迅速發(fā)展和應(yīng)用，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)（American Chemical Society，ACS）已將免疫分析與氣相色譜、液相色譜共同列為農(nóng)藥、獸藥、漁藥殘留分析的三大支柱技術(shù)[19]。

手性藥物對(duì)映體的分離和分析需要合適的載體，而高立體選擇特異性的抗體幾乎能用于識(shí)別包括手性藥物在內(nèi)的所有化合物[20]。早在20世紀(jì)初，Landsteiner研究利用D-酒石酸抗體來(lái)分辨酒石酸的對(duì)映異構(gòu)體，證明抗體能夠分辨手性化合物的立體異構(gòu)體，為抗體的立體選擇性行為奠定了研究基礎(chǔ)[21]。近年來(lái)，科研人員開(kāi)始利用抗體這一特性來(lái)分析研究手性化合物。他們把抗體作為色譜手性選擇劑分離和純化對(duì)映異構(gòu)體，現(xiàn)已有多種手性藥物如布諾芬、芬羅唑、二芳烷基三唑等成功通過(guò)免疫親和色譜法進(jìn)行拆分[22-24]。此外，利用抗體對(duì)手性藥物的立體選擇性，多種高靈敏度、高特異性的對(duì)映體免疫檢測(cè)分析法也被逐漸建立起來(lái)，包括放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、熒光免疫分析（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）、熒光免疫微陣列法（fluorescence microarray）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和免疫傳感器（immunosensor）等。RIA已經(jīng)被用于各種手性藥物和代謝物、類(lèi)固醇、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的立體選擇性檢測(cè)，但由于用來(lái)標(biāo)記的放射性元素價(jià)格昂貴，且用量受到法律嚴(yán)格限制，因此近年來(lái)該方法在手性藥物分析上的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。相比之下，操作安全簡(jiǎn)便的ELISA是個(gè)很好的代替，而且靈敏度高、特異性和精密度也很好，價(jià)格也比較便宜，近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外在手性藥物ELISA方法建立的研究較為活躍，并以此來(lái)研究手性藥物對(duì)映體與抗體或蛋白結(jié)合能力的文獻(xiàn)報(bào)道也不斷增多。表1列舉了近年來(lái)各種免疫分析方法在手性藥物分析研究的應(yīng)用情況。

2 手性免疫識(shí)別機(jī)制研究進(jìn)展

雖然近年來(lái)免疫分析方法在手性藥物的分析研究中已取得較好的發(fā)展，但是其應(yīng)用普及程度仍不如色譜分析法。這是因?yàn)槊庖叻治龇椒ㄖ锌贵w是通過(guò)手性半抗原藥物與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)后周期性免疫動(dòng)物來(lái)獲取的，抗體的立體結(jié)構(gòu)及特性等具有不可預(yù)測(cè)性。在缺乏理論指導(dǎo)下，抗體制備的結(jié)果往往不能如愿[37-38]。如果能揭示和闡明手性抗體與手性藥物之間的立體選擇性識(shí)別機(jī)制，即可利用該機(jī)制改善手性半抗原的設(shè)計(jì)或從分子水平上改造抗體的性能[39]，為免疫分析法在手性藥物的分析研究應(yīng)用提供重要的理論指導(dǎo)。因此，近年來(lái)手性抗體與對(duì)映異構(gòu)體之間的相互作用、識(shí)別機(jī)制的研究已成為了手性藥物免疫分析研究的新熱點(diǎn)。

表1 免疫分析法在手性藥物分析中的應(yīng)用Table1 Applications of immunoassay for detecting chiral drugs

2.1 抗體交叉反應(yīng)及其立體選擇識(shí)別的研究

通過(guò)免疫分析法獲取抗體與手性半抗原藥物及其類(lèi)似物之間的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)，結(jié)合化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行直觀分析，是目前研究抗體與手性半抗原識(shí)別機(jī)制最簡(jiǎn)單也是最常用的方法。

Shan Guomin等[33]在酯鍵水解3-[4-（3-甲酰苯氧基）苯基]丙酸芐酯后與S-氰戊菊酸連接制得半抗原，分別與牛血清白蛋白偶聯(lián)制得包被抗原及與血藍(lán)蛋白（limpet hemocyanin，LPH）偶聯(lián)制得免疫半抗原，免疫所得多克隆抗體與（1S，2R）、（1R，2S）、（1R，2R）、（1S，2RS）、（1R，2RS）、（1RS，2RS）等不同構(gòu)型的氰戊菊酯進(jìn)行交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率分別為（93±7）%、（14±4）%、（1.8±0.8）%、（97±3）%、（14±2）%、（60±9）%。結(jié)果表明菊酯的酸部分比醇酮部分更能決定抗體的立體選擇性，并進(jìn)一步推測(cè)半抗原離蛋白越遠(yuǎn)越能決定抗體立體選擇性。

Cao Mengmeng等[40]使用S-生物丙烯菊酯單一異構(gòu)體（1R，3R，4’S）合成半抗原，在恰當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)引入合適的間隔壁并保持菊酸和醇酮手性位點(diǎn)的構(gòu)型（圖1），獲得的抗體對(duì)ES-生物丙烯菊酯（1R，3R，4’RS）、右旋丙烯菊酯（1R，3RS，4’RS）、丙烯菊酯（1RS，3RS，4’RS）有較大的交叉反應(yīng)率，分別為59.3%、42.3%、21.7%，表明抗體對(duì)4’S構(gòu)型的對(duì)映體比4’R構(gòu)型的對(duì)映體有更好的親和性，但卻很難識(shí)別1S和3S位點(diǎn)，這證明菊酯的手性位點(diǎn)都具有立體選擇性，并且菊酯的酸部分比丙烯醇酮部分更能決定抗體的立體選擇性，而離蛋白越遠(yuǎn)的手性位點(diǎn)對(duì)抗體立體選擇性作用越強(qiáng)。

圖1 生物丙烯菊酯半抗原的合成設(shè)計(jì)[[4400]]Fig. 1 Synthetic route to the hapten[40]

圖2 萊克多巴胺與去羥基萊克多巴胺結(jié)構(gòu)示意圖[[4411]]Fig.2 Structures of ractopamine and des-hydroxy ractopamine[41]

Shelver等[41]用消旋體萊克多巴胺制備出相應(yīng)的單克隆抗體，研究發(fā)現(xiàn)該抗體與對(duì)映體（1R，3R）的親和性最強(qiáng)，其交叉反應(yīng)率高達(dá)489%，而對(duì)映體（1R，3S）交叉反應(yīng)率只有0.9%。若改變C1的構(gòu)型為S型，其對(duì)映體（1S，3R）與抗體的親和力則無(wú)太大變化。這表明抗體與該手性半抗原結(jié)合時(shí)，其手性識(shí)別位點(diǎn)主要為C3。此外，在將C1上的β-羥基去掉后（圖2），把只剩下C3一個(gè)手性碳原子的對(duì)映體與抗體反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C3的構(gòu)型為R型時(shí)C1上β-羥基的存在與否對(duì)于抗體的親和力無(wú)太大影響，而當(dāng)C3為S型時(shí)C1上β-羥基的存在則會(huì)進(jìn)一步降低手性半抗原與抗體的親和力。

Pierre等[42]利用異構(gòu)體與抗體的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)研究了手性碳與偶聯(lián)蛋白的距離對(duì)手性識(shí)別的影響。兩種間隔臂不同的半抗原（抗焦慮藥S-20499）分別與蛋白偶聯(lián)并免疫兔子，得到了兩種手性多抗（S1，S2）。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種抗體都能立體選擇性識(shí)別S-20499，與另一個(gè)對(duì)映體的交叉反應(yīng)＜0.1%。而S2與藥物各種類(lèi)似物的交叉反應(yīng)均比S1要低。這說(shuō)明對(duì)于抗焦慮藥S-20499，偶聯(lián)蛋白與手性中心的距離對(duì)所產(chǎn)生的抗體的立體選擇性無(wú)影響，但用間隔臂長(zhǎng)的免疫原生產(chǎn)抗體既能保持抗體有足夠強(qiáng)的對(duì)映體選擇性，又能提高抗體的結(jié)構(gòu)特異性。

以上文獻(xiàn)說(shuō)明，結(jié)合手性藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析其交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)能在表觀上推測(cè)手性抗體與手性半抗原識(shí)別的重要位點(diǎn)，以及哪些官能團(tuán)可能對(duì)其立體選擇性造成影響。然而，決定手性抗體立體選擇性的因素有很多，如手性碳原子的位置、連接手性碳原子的基團(tuán)、抗原結(jié)合位點(diǎn)的疏水性、抗原抗體結(jié)合的親和力等[43]，用該方法所能獲得的信息有限，而且其推測(cè)的規(guī)律具有不確定性，在解釋復(fù)雜的手性免疫識(shí)別機(jī)制上存在一定的局限性。

2.2 分子模擬技術(shù)在手性免疫識(shí)別機(jī)制的應(yīng)用研究

為進(jìn)一步科學(xué)闡釋手性抗體與對(duì)映體的立體選擇性機(jī)制，近年來(lái)有研究者開(kāi)始嘗試?yán)梅肿幽M等計(jì)算機(jī)技術(shù)來(lái)輔助建立小分子有害物的免疫檢測(cè)分析方法，取得了一定的進(jìn)展。分子模擬和分子對(duì)接是一種有效的并能深層次分析手性抗體與手性半抗原作用機(jī)制的研究手段。它利用基因工程方法獲取手性抗體的基因序列，然后利用軟件模擬出抗體結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)與手性半抗原模擬結(jié)合來(lái)得知兩者的空間結(jié)構(gòu)變化以及相互作用類(lèi)型等信息。這種模擬方法可以提供許多實(shí)驗(yàn)獲得不到的信息，如原子電荷、軌道參數(shù)、靜電勢(shì)等，可在免疫分析中用于輔助設(shè)計(jì)半抗原、解釋交叉反應(yīng)以及抗體識(shí)別機(jī)制等，在小分子免疫檢測(cè)分析技術(shù)研究中具有很好的應(yīng)用前景[44]。

Ranieri等[45]利用單克隆抗體提供的基因信息，在SWISS-MODEL軟件上構(gòu)建了抗右旋氨基酸抗體結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)（圖3），并與D-芳香族氨基酸進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半抗原的大部分結(jié)構(gòu)牢牢陷入了抗體結(jié)合位點(diǎn)的大空腔中，并與結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸殘基形成了4個(gè)氫鍵。同時(shí)結(jié)合過(guò)程中還包括了多個(gè)疏水相互作用，半抗原的側(cè)鏈與抗體結(jié)合位點(diǎn)上的色氨酸、酪氨酸殘基形成了π-π疊合。相反，與L-芳香族氨基酸進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)，由于空間位阻的關(guān)系半抗原無(wú)法進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)的空腔中。這說(shuō)明，手性抗體與D-芳香族氨基酸的選擇性結(jié)合是空間結(jié)構(gòu)吻合與化學(xué)鍵形成的共同結(jié)果。

圖3 用SWISS-MODEL模擬的抗L-芳香族氨基酸抗體表面輪廓及與抗原結(jié)合的位點(diǎn)[[4455]]Fig.3 Surface contour representation of anti-L-AA using SWISS-MODEL[45]

Geva等[46]利用左旋亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸三聯(lián)體晶體制備了具有不同特異性的兩株單克隆抗體。48E抗體能特異識(shí)別三聯(lián)體左旋晶面，而不識(shí)別其右旋晶面或者其他非手性晶面，602E抗體則能識(shí)別三聯(lián)體的所有晶面。在構(gòu)建這兩種抗體結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)并與三聯(lián)體的不同晶面進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)發(fā)現(xiàn)，48E抗體結(jié)合位點(diǎn)上主要為親水性的氨基酸殘基，而沒(méi)有帶電荷的氨基酸殘基。其CDRs區(qū)的L1和H3環(huán)形成了一個(gè)“脊”，并與三聯(lián)體的L-晶面上的“槽”相吻合，在其中一個(gè)結(jié)合模型中形成了9 個(gè)氫鍵和12 個(gè)疏水相互作用。而與三聯(lián)體D-晶面對(duì)接時(shí)，雖然抗體與晶面在空間上的吻合度與L-晶面相當(dāng)，但形成的氫鍵和疏水相互作用力卻少了很多（圖4）。相反，采用602E抗體與所有晶面對(duì)接時(shí)其在空間結(jié)構(gòu)上都不能互相吻合，也沒(méi)有形成化學(xué)鍵，但其結(jié)合位點(diǎn)上大量的帶電荷的氨基酸殘基與每個(gè)晶面結(jié)合時(shí)都能產(chǎn)生靜電作用，導(dǎo)致了該抗體能識(shí)別三聯(lián)體的所有晶面。由此推斷，抗體的特異性是通過(guò)空間互補(bǔ)與化學(xué)相互作用實(shí)現(xiàn)的，后者是抗體具有手性識(shí)別能力的基礎(chǔ)。而具有廣譜特異性的抗體與半抗原結(jié)合時(shí)的作用力主要為靜電作用，且該作用力比空間位阻影響更大。

圖4 48E抗體（a、b）和602E抗體（c）分別與左旋亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸三聯(lián)體晶體對(duì)接模型[[4466]]Fig.4 Docking models of antibody 48E (a, b) and antibody 602E (c) on the face of the (L)Leu-(L)Leu-(L)Tyr crystal[46]

Nevanen等[47]構(gòu)建了抗左旋芬羅唑抗體的三維模型，分別與芬羅唑?qū)τ丑w進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體上有多個(gè)氨基酸殘基與抗體的結(jié)合空腔大小、空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、疏水相互作用、氫鍵作用以及π-π疊合的形成有關(guān)。將這些與抗體親和性有關(guān)的氨基酸殘基分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，其中有4 種突變體既保持原有的對(duì)映體選擇性，又在一定程度上降低了對(duì)左旋芬羅唑的親和性，可在親和色譜中循環(huán)使用。這些成功被改造的抗體片段其被突變的氨基酸殘基本身與左右旋芬羅唑的氟苯基都能形成相互作用，故改變這些氨基酸不會(huì)對(duì)抗體的立體選擇性造成太大影響。

2.3 定量構(gòu)效關(guān)系在手性免疫分析中的研究應(yīng)用

定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是在構(gòu)效關(guān)系（structure-activity relationship，SAR）研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的活性分子進(jìn)行分析，以化合物的結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)為自變量，生物活性為因變量，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法建立起化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的 定量關(guān)系[48]。QSAR旨在揭示化合物生物活性如何隨著化合物的結(jié)構(gòu)及理化參數(shù)的變化而改變，從而推測(cè)其可能的作用機(jī)理，其建立的數(shù)學(xué)模型還可以對(duì)化合物的分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)或生物活性的關(guān)系給予定量描述，從而達(dá)到預(yù)測(cè)尚未研究的化學(xué)行為的目的。

在免疫分析中，第一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是設(shè)計(jì)半抗原。通常半抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)的一點(diǎn)小改變，都可能會(huì)引起其空間結(jié)構(gòu)較大的變化而導(dǎo)致抗體制備的失敗。而在手性藥物的免疫分析中，為了獲得高特異選擇性的抗體，半抗原的設(shè)計(jì)就顯得更重要和要求更高。然而由于對(duì)抗原抗體作用機(jī)理的了解不多，目前半抗原的設(shè)計(jì)大多仍處于對(duì)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，通過(guò)大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證半抗原的設(shè)計(jì)是否合理，這耗費(fèi)了很多寶貴的時(shí)間和精力。為了克服傳統(tǒng)方法帶來(lái)的大量盲目合成和篩選的弊端，更加有效地制備高特異選擇性抗體和建立免疫學(xué)方法，人們開(kāi)始借助QSAR來(lái)模擬其空間結(jié)構(gòu)和描述其物理化學(xué)特征（如靜電勢(shì)），促進(jìn)免疫分析技術(shù)的發(fā)展。

2.3.1 定量構(gòu)效關(guān)系在半抗原設(shè)計(jì)上的應(yīng)用研究

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始有科研人員應(yīng)用QSAR進(jìn)行半抗原輔助設(shè)計(jì)。如Pinacho等[49]借助模型設(shè)計(jì)了氟喹諾酮類(lèi)抗生素的半抗原，以此制備的抗體能夠靈敏地識(shí)別10種氟喹諾酮藥物。為了得到高特異性的抗體，陳秀金[50]在設(shè)計(jì)擬除蟲(chóng)菊酯半抗原時(shí)利用計(jì)算機(jī)軟件Discovery Studio 2.5和Gaussian 04對(duì)半抗原和菊酯的結(jié)構(gòu)進(jìn)行空間模擬和原子電荷計(jì)算，選擇與菊酯空間結(jié)構(gòu)和電荷分布最匹配的半抗原為免疫半抗原，選擇二者差異較大的為包被半抗原。通過(guò)測(cè)定氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯共14 個(gè)單體的抑制曲線來(lái)研究菊酯單克隆抗體的立體選擇性。結(jié)果表明，抗體只識(shí)別氯氰菊酯的單體CP6（1S，3S，αS）和單體CP7（1S，3S，αR）、甲氰的單體FP2（αS型）以及氰戊菊酯的單體FV1（αS S），而且CP7比CP6靈敏度要高很多。

2.3.2 定量構(gòu)效關(guān)系在抗原抗體相互作用上的研究

近年來(lái)，QSAR分析技術(shù)還被用于解釋抗體與不同藥物（包括手性藥物）的識(shí)別能力。如王戰(zhàn)輝等[51]利用氟諾喹酮類(lèi)抗生素抗體的活性值和分析物結(jié)構(gòu)參數(shù)建立了3D-QSAR模型，應(yīng)用比較分子立場(chǎng)分析（comparative molecular field analysis，CoMFA）研究解釋了抗體的交叉反應(yīng)。

陳秀金[50]基于菊酯單克隆抗體對(duì)氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯14 個(gè)對(duì)映體單體交叉反應(yīng)的結(jié)果，構(gòu)建了3 種QSAR即二維定量構(gòu)效（2D-QSAR）模型、全息定量構(gòu)效（HQSAR）模型和虛擬定量構(gòu)效（topomer QSAR）模型。由2D-QSAR模型得出，抗體活性和菊酯的疏水性大小、氫受體的個(gè)數(shù)有關(guān)，而且菊酯的疏水性越小，抗體識(shí)別能力會(huì)越好。HQSAR模型從亞結(jié)構(gòu)水平分析發(fā)現(xiàn)在免疫反應(yīng)中暴露比較少的片斷，對(duì)抗體活性也有一定的影響。2D-QSAR模型和HQSAR模型的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2=0.92，表明這2 個(gè)模型具有很好的預(yù)測(cè)能力。此外以氰戊菊酯為例將各化合物切成3 段R1，R2和中間共同部分，通過(guò)構(gòu)建topomer QSAR模型計(jì)算分子關(guān)鍵片段（R2）的空間場(chǎng)和靜電場(chǎng)等高勢(shì)（圖5），來(lái)解釋擬除蟲(chóng)菊酯抗體與對(duì)映體單體的交叉反應(yīng)。

圖5 片段R2的空間場(chǎng)(a)和靜電場(chǎng)(b)的等高勢(shì)圖[[5500]]Fig.5 Steric contour map (a) and electrostatic contour map (b) of fragment R2[50]

此外，通過(guò)建立QSAR模型還可對(duì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)和抗體活性之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，探索抗原抗體的作用機(jī)理。Yuan Meng等[52]利用苯基脲類(lèi)除草劑交叉反應(yīng)結(jié)果建立2D-QSAR和HQSAR模型，研究表明對(duì)抗體識(shí)別影響最大的結(jié)構(gòu)參數(shù)為苯基脲類(lèi)除草劑的疏水性；盡管半抗原和載體蛋白之間的連接臂在免疫反應(yīng)中暴露較少，但通過(guò)亞結(jié)構(gòu)水平分析發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)對(duì)于抗原抗體之間的相互作用也起著重要的作用；此外，模型也顯示苯基脲類(lèi)除草劑分子的前沿未占軌道能量參數(shù)的也會(huì)影響免疫反應(yīng)。

3 結(jié) 語(yǔ)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)手性農(nóng)藥獸 藥不同對(duì)映體生物活性研究等方面不斷深入，規(guī)范手性農(nóng)藥獸藥使用的環(huán)保法規(guī)將變得日益嚴(yán)格，各種手性農(nóng)藥獸藥殘留分析檢測(cè)技術(shù)將得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，并將向系統(tǒng)化、規(guī)范化、小型化和自動(dòng)化方向發(fā)展。 而高立體選擇性、高特異性的抗體除了被廣泛運(yùn)用到RIA、ELISA等免疫分析方法中去外，近年來(lái)也開(kāi)始被制成手性抗體柱 和手性光學(xué)傳感器等運(yùn)用到手性親和色譜法和表面等離子體共振光譜（surface plasmon resonance，SPR）[53]等中。

雖然手性抗體已被較為廣泛地應(yīng)用到手性藥物的分離和分析檢測(cè)中，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)抗體與手性對(duì)映體識(shí)別機(jī)制的研究無(wú)論是方法還是數(shù)據(jù)結(jié)論都比較有限。近年來(lái)，人們?cè)谑中运幬锩庖叻治鲅芯康幕A(chǔ)上開(kāi)始借助計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)和多種現(xiàn)代儀器分析手段如X射線晶體衍射（X-ray crystallography）[54]、熒光光譜法（fluorescence spectr um，F(xiàn)S）[55]等研究抗體與手性對(duì)映體間的相互作用及其識(shí)別機(jī)制。相信隨著免疫分析方法與其他各種分析方法的合理搭配運(yùn)用，從多方面多角度來(lái)研究手性抗體和對(duì)映體藥物反應(yīng)過(guò)程，將會(huì)有更多、更詳細(xì)、更準(zhǔn)確的信息可用來(lái)完善免疫學(xué)原理以及解釋手性抗體與手性藥物的識(shí)別機(jī)制。

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Advances in Immunoassay of Chiral Pesticides and Veterinary Drugs

ZENG Hao-peng, LEI Hong-tao*, ZHANG Chi-jian, SUN Yuan-ming, XU Zhen-lin, YANG Jin-yi
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangdong Provincial Engineering and Technique Research Centre of Food Safety Detection and Risk Control, Collaborative Innovation Center of South China Poultry Disease Prevention-Control and Product Safety, Guangzhou 510642, China)

The enantiomers of chiral drugs exhibit stereoselective differences in their metabolic transformation and toxicity in living organisms. Therefore, there is a need for deeper research and analysis of chiral pesticides and veterinary drugs in the form of enantiomers. Immunoassay has attracted increasing attention in the field of chiral pesticides and veterinary drugs because of its fast operation, high specificity and excellent sensitivity. The recent applications of immunoassay in the detection of chiral pesticides and veterinary drugs are summarized. Meanwhile, this paper presents a review of recent advances in the application of antibody stereoselectivity, molecular simulation and quantitative structure-activity relationship in the immune recognition mechanism. Moreover, future trends in the research and application of immunoassay in this field are discussed.

chiral; pesticides; veterinary drugs; immunoassay; recognition mechanism

TS207.3

A

1002-6630（2014）21-0315-07

10.7506/spkx1002-6630-201421060

2014-03-31

NSFC-廣東聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1301214）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013030013338）；2013年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20114404130002）；廣東省高等學(xué)校成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（cgzhzd0808）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201003008-08）

曾皓鵬（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：zenghp1988@163.com

*通信作者：雷紅濤（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓治龌瘜W(xué)。E-mail：hongtao@scau.edu.cn